体外诱导小鼠胚胎干细胞定向分化及AFM的可视化研究

摘要

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES cell)在细胞诱导分化方面具有可塑性强、分裂增值旺盛和免疫原性低等特点,为进行细胞移植治疗疑难疾病带来希望。为了能够揭示ES细胞在体外细胞因子的调控下发生定向分化,其膜表面形态学的变化及其对应的生物学意义,本文在体外培养BALB/c小鼠ES细胞定向分化为胰岛样细胞团,利用原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)追踪观察培养各时期细胞表面形态学上的变化,探索AFM在细胞生物学领域的应用。
　　本文首先选用BALB/c小鼠ES细胞,培养至拟胚体自然分化四天,然后转入白明胶处理的培养板上使拟胚体贴壁生长,在特定时间段分别于培养液中添加一系列细胞因子(bFGF、IGF-1和Nicotinamide),使ES细胞定向分化为胰岛样细胞团,并且在培养的每个时期用AFM扫描细胞,这在国内、外尚属首次。本文首次从超微形态上发现ES细胞增殖克隆的两种方式(对称性分裂和非对称性分裂),以及拟胚体至转化的细胞团期间细胞表面形貌的变化：加入生长因子bFGF后,内胚层细胞大量增殖,外胚层的分化接受其调控变得有序起来,扫描外胚层先发现大量类似于神经纤维(包括树突和轴突)的细胞,随后类似神经系统的细胞几乎相互连成网络状,纤维交织杂乱,还观察到接近于圆形的细胞,可能是分化出的神经元,作为信息交流传导的中枢。添加生长因子IGF-1和Nicotinamide后,外胚层细胞随时间的推进而逐渐减少,内胚层细胞分化为胰岛样细胞团,但是在其细胞膜上,我们却没有观察到很大的变化。结合ICC结果,观察到表达胰岛B细胞的细胞数量庞大,在阳性细胞的表面有丰富的纤维组织,这些类神经细胞纤维可能调节其激素的释放,从而首次从超微形态上有力地印证了外胚层的神经干细胞和内胚层的胰岛干细胞是同源的理论,为细胞的移植疗法提供了可靠的凭据。另外还通过添加不同的生长因子,诱导BALB/c小鼠ES细胞定向分化为肝细胞,并最终获得32%的高分化率。
　　通过AFM的运用,我们可以从完全不同于传统生物学和医学的角度来观察分析我们的研究对象,可视化研究干细胞的发育变化,获得一些特殊而重要的信息,发现和探讨一些用其它技术无法或还未涉及的细胞生物学现象和理论,拓展了干细胞研究的手段,有助于细胞生物学理论和技术的发展。

目录

摘要

Abstract

第一章 原子力显微镜及其在生命科学研究中的应用

1.1 原子力显微镜的诞生及发展

1.2 原子力显微镜的构造及原理

1.2.1 AFM的分辨率

1.2.2 AFM的工作模式

1.2.3 AFM中针尖与样品之间的作用力

1.2.4 成像环境与载体选择

1.2.5 AFM的优点与缺点

1.3 原子力显微镜在生命科学研究中的应用

1.3.1 AFM应用于分子生物学研究

1.3.2 AFM应用于细胞生物学研究

1.4 原子力显微镜在细胞生物学领域的不足

1.5 展望未来

参考文献

第二章 干细胞研究的基本情况

2.1 干细胞的定义与分类

2.2 干细胞的生物学特性

2.3 干细胞生物学的研究内容

2.4 胚胎干细胞

2.5 胚胎干细胞的分离

2.6 胚胎干细胞的生物学特性

2.7 胚胎干细胞的定向分化

2.8 胚胎干细胞的应用

参考文献

第三章 体外诱导BALB／c小鼠ES细胞定向分化为胰岛样细胞团及培养各阶段的AFM追踪观察

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 结果与讨论

3.2.1 光镜观察ES细胞生长及自然分化过程

3.2.2 ICC结果

3.2.3 AFM观察结果

3.3 结论

参考文献

第四章 体外诱导BALB／c小鼠ES细胞定向分化为肝细胞的实验研究

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 方法

4.2 结果

4.2.1 ES和EB生长发育

4.2.2 定向诱导培养的细胞生长状态

4.2.3 RT-PCR结果

4.2.4 ICC结果

4.2.5 RIA结果

4.2.6 肝细胞分化率

4.3 讨论

4.4 结论

参考文献

攻读硕士学位期间参加科研工作基本情况

致谢