卵巢上皮性肿瘤中神经内分泌细胞的分布及部分作用研究

摘要

目的： 1.明确卵巢上皮性肿瘤神经内分泌(neuroendocrine，NE)分化，并探讨其生物学特性； 2.探讨IL-24对体外培养的卵巢癌细胞凋亡诱导作用及NE分化效应。 方法 ：1.应用免疫组织化学方法检测卵巢上皮性肿瘤组(n=79)与对照组(正常卵巢n=22)嗜铬素A(chromograninA，CgA)表达，对CgA阳性标本再行CgA/EMA、Ki67/CgA双重免疫组织化学染色和TUNEL/CgA双重染色，并进行图像分析。 2.采用透射电子显微镜技术观察正常卵巢组(育龄期n=3，绝经期n=3)、卵巢浆液性囊腺瘤组(n=3)、卵巢粘液性囊腺瘤组(n=3)、卵巢浆液性囊腺癌(n=3)及其转移瘤组(n=2)神经内分泌细胞(neuroendocrinecells，NECs)超微结构特征。 3.皮下接种复制人卵巢浆液性腺癌裸小鼠动物模型。采用以下方法验证模型：免疫组织化学方法检测移植瘤CA125、CK表达；透射电子显微镜技术观察肿瘤细胞超微结构特征。 4.取裸鼠移植瘤组织，体外培养人卵巢浆液性腺癌细胞，HE染色、免疫细胞化学方法检测CA125、CK，图像分析结果进行细胞鉴定；细胞染色体核型分析；免疫细胞化学方法检测培养细胞的CgA表达，并进行图像分析。 5.分别以DDP(1.5、3ug/mL)、不同浓度IL-241、2、4、8、16、32g/L和两药合用对体外培养的卵巢癌细胞进行干预，分为对照组、DDP组、IL-24组和两药合用组。MTT法、台盼蓝排出实验观察各实验组细胞活力；流式细胞术观察细胞凋亡状况及周期分布；免疫细胞化学方法检测各实验组细胞CgA表达，并进行图像分析。 结果： 1.卵巢上皮性肿瘤NE分化及与临床病理参数关系 CgA在正常卵巢、良性浆液性、粘液性、交界性和恶性浆液性、粘液性肿瘤组中表达阳性率分别为31.8﹪、42.8﹪，60.0﹪、62.5﹪、58.3﹪、75.0﹪。组间差异在统计学上有显著性(χ2=31.191，P＜0.01)。正常卵巢组织中CgA阳性细胞稀少；卵巢上皮性肿瘤中CgA阳性细胞常单个穿插于腺上皮细胞之间或相对集中位于腺体、粘液上皮、实性巢及血管周围等处。CgA染色强度卵巢癌组＞良性肿瘤组＞正常卵巢组。CgA表达强度卵巢癌组比正常卵巢组明显增强。在各肿瘤组间，CgA表达强度交界性肿瘤组＞良性肿瘤组，恶性肿瘤组明显＞良性肿瘤组，而交界性肿瘤组与恶性肿瘤组比较差异无统计学意义(P=0.154，＞0.05)。CgA表达阳性率与患者的年龄无关(r=0.700，P=0.188)，临床分期Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期(χ2=10.889，P=0.004)。恶性卵巢上皮性肿瘤组织中，CgA表达与组织分级呈正相关(r=0.5765，P=0.003)，在组织分化Ⅲ级中的表达高于Ⅰ级(P=0.012，＜0.05)。 2.卵巢上皮性肿瘤NE分化机制初探 正常卵巢及其上皮性肿瘤组织中，约92﹪CgA阳性细胞表达EMA，可见CgA、EMA双重表达细胞，少数CgA阳性细胞不表达EMA。 3.卵巢上皮性肿瘤中NECs增殖与凋亡状况研究 少数CgA阳性细胞表达Ki67，可见CgA、Ki67双重表达细胞，CgA阳性细胞所在腺体Ki67表达阳性细胞较多。而在正常卵巢组织中，CgA阳性细胞不表达Ki67。 TUNEL/CgA双重染色，未见双阳性表达细胞，CgA阳性细胞富集区域及附近凋亡细胞罕见。 4.正常卵巢及其上皮性肿瘤中NECs超微结构观察 具有共同的超微结构特征：胞质内有高电子密度的NE颗粒，随组织的良恶性、组织分型、功能状态，颗粒的多少、大小、形状和电子密度有所不同。5.体外培养的卵巢浆液性腺癌细胞NE分化 移植瘤组织表达CA125、CK，超微结构特征证实模型复制成功。体外培养的卵巢浆液性腺癌细胞约95.23﹪表达CK，78.57﹪表达CA125，4.63﹪的细胞表达CgA，CgA染色强度PU=38.56±3.54。细胞染色体核型分析示：超二倍体，为人型。 6.IL-24诱导体外培养的卵巢癌细胞凋亡的作用 6.1IL-24对体外培养的卵巢癌细胞存活率及凋亡的影响 IL-24与DDP单独和联合作用于卵巢癌细胞24h后，随IL-24浓度增高卵巢癌细胞存活细胞百分数呈下降趋势；32g/L浓度的IL-24干预后，卵巢癌细胞活细胞百分数为64.68﹪，细胞凋亡比率9.5﹪，细胞周期阻滞于G2/M期，相对于对照组明显减少(P=0.035，＜0.05)。DDP组卵巢癌细胞活细胞百分数明显下降，细胞凋亡比率11.5﹪，周期阻滞于G2/M期，与对照组比较差异显著(P=0.005、0.009，＜0.01)。两药合用组比高浓度16、32g/LIL-24和DDP组，卵巢癌细胞存活细胞百分数增高(P＞0.05)，细胞凋亡比率4.2﹪；低浓度1、2、4g/LIL-24与DDP组比较，卵巢癌细胞存活比率高(P=0.035，0.017，0.027，＜0.05)。统计分析显示：对卵巢癌细胞生存率的影响贡献依次是联合用药＞L-24＞DDP。 6.2IL-24对体外培养的卵巢癌细胞CgA蛋白表达的影响 CgA染色，对照组阳性细胞占4.63﹪；半量DDP组阳性细胞百分率3.85﹪；IL-24组各浓度间阳性细胞百分率变化不大，平均为3.19﹪；16g/LIL-24+半量DDP组为3.00﹪。 结论： 1.卵巢上皮性肿瘤存在不同程度的NE分化，其分化程度随肿瘤恶性程度、临床分期升高，组织分级下降而加强。 2.卵巢上皮性肿瘤中的NECs常单个穿插于腺上皮细胞之间或相对集中位于腺体、粘液上皮、实性巢及血管周围等处。它们可能来自其基底层的上皮干细胞。 3.正常卵巢中的NECs属暂不增殖，也不发生凋亡的一群细胞。而其上皮性肿瘤中的NECs可随肿瘤细胞的增殖而增生，它们亦不凋亡，其分泌产物抑制周围非NECs的凋亡。 4.正常卵巢及其上皮性肿瘤中的NECs具有共同的超微结构特征：胞质内有高电子密度的NE颗粒，随组织的良恶性、组织分型、功能状态，颗粒的多少、大小、形状和电子密度有所不同。 5.移植瘤免疫组织化学、超微结构特征证实模型复制成功。体外培养的人卵巢浆液性腺癌细胞也存在NE分化，更进一步证实NECs是肿瘤细胞的成分。 6.IL-24可诱导卵巢癌细胞凋亡，使细胞周期阻滞于G2/M期。短期应用可诱导卵巢癌细胞良性转化，但暂与其神经内分泌分化无关。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及学位论文版权使用授权书

前言

1.女性生殖系统的神经内分泌细胞

2.卵巢上皮性肿瘤中神经内分泌细胞的分布及意义

3.恶性卵巢上皮性肿瘤的诱导分化治疗与体外治疗模型的选择

4.白细胞介素(IL)-24治疗恶性卵巢上皮性肿瘤的设想

5.卵巢上皮性肿瘤神经内分泌分化的评价及本课题研究方案

参考文献

第一部分卵巢上皮性肿瘤神经内分泌分化及其生物学特性的研究

材料与方法

结果

讨论

图版

第二部分正常卵巢及其上皮性肿瘤NECs超微结构的观察

材料与方法

结果

讨论

图版

第三部分体外培养的卵巢浆液性腺癌细胞神经内分泌分化

材料和方法

结果

讨论

图版

第四部分IL-24诱导体外培养的卵浆液性腺癌细胞凋亡的研究

材料和方法

结果

讨论

图版

全文结论

参考文献

英文缩略词表

在读期间撰写和发表的文章

致谢