类波氏真眼点藻二酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因的克隆与功能分析

摘要

类波氏真眼点藻(Eustigmatos cf.polyphem)属于异鞭藻门(Heterokontophyta)真眼点藻纲(Eustigmatophyceae),是一种土壤黄绿色单细胞微藻。前期研究证实,该藻能合成多不饱和脂肪酸、β-胡萝卜素和金藻昆布糖等高附加值生物活性物质,特别是在氮限制培养后期能大量积累储藏性油脂,是一株具有生物产品和生物燃料开发潜能的微藻。本文以类波氏真眼点藻(E.cf.polyphem)为研究材料,克隆藻细胞TAG合成途径中二酰甘油酰基转移酶(Diacylglycerol acyltransferase,DGAT)基因的cDNA全长序列,通过外源表达确定基因的具体功能,探讨类波氏真眼点藻(E.cf.polyphem)在氮限制培养时TAG积累过程中DGAT的转录水平表达情况,了解类波氏真眼点藻(E.cf.polyphem)中TAG合成代谢的分子机理与调控机制,为微藻生物能源的开发提供一定的理论依据。研究结果如下:
　　(1)利用RACE技术扩增得到类波氏真眼点藻(E.cf.polyphem)二酰甘油酰基转移酶基因EcfpDGATb的cDNA全长序列2347 bp,同时分别得到EcfpDGATa和EcfpDGATc的3’ cDNA序列309 bp和480 bp。
　　(2)DNA序列分析发现EcfpDGATb全长cDNA含有23 bp5’和338 bp3’非翻译区(Untranslated Regions,UTR)序列,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)1986 bp,编码661个氨基酸;该蛋白质N端具有43个氨基酸长度的预测信号肽和9个预测跨膜区,结构域中包含6个II型DGAT的保守基序,说明EcfpDGATb可能属于编码II型DGAT的基因家族成员。
　　(3)EcfpDGATb的异源表达证实其能使TAG合成缺陷酵母菌株恢复部分的油滴积累能力,并偏好于利用16C不饱和与18C脂肪酸合成TAG,说明EcfpDGATb参与TAG的生物合成过程。
　　(4)EcfpDGATb的mRNA相对表达量在两种硝酸钠浓度培养条件下都呈现先上升后下降的趋势,在高氮组(18 mmol/L NaNO3)中培养36 h时达到最高相对表达量,低氮组(6 mmol/L NaNO3)在96 h达到最高,表明EcfpDGATb mRNA水平的表达对氮限制有一定的响应。

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一、 前言

1 TAG合成途径和关键酶

2 DGAT的研究进展

3 类波氏真眼点藻的生物学特征及其研究进展

4 本文研究的内容和意义

二、 材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

3 实验设计

4 数据处理与分析

三、 结果与分析

1 EcfpDGAT转录本cDNA序列的验证

2基因cDNA全长的克隆

3 EcfpDGATb 的序列分析

4 EcfpDGATb的功能鉴定

5两种硝酸钠浓度培养的藻细胞中EcfpDGATb mRNA水平的表达

四、 讨论

1 EcfpDGAT从转录本到cDNA全长的克隆

2 EcfpDGATb的序列分析及类型确定

3 EcfpDGATb的功能研究

4氮限制培养藻细胞中EcfpDGATb mRNA的表达模式

五、 结论及展望

1 结论

2 展望

参考文献

附录

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致谢