α2,3唾液酸转移酶Ⅲ调节卵巢癌细胞对紫杉醇敏感性的研究

摘要

研究目的：
　　本课题研究α2,3唾液酸转移酶Ⅲ（ST3Gal-Ⅲ）在卵巢癌株对紫杉醇敏感性中的作用，探讨二者对肿瘤细胞杀伤的协同效应，为临床治疗复发性和耐药性卵巢癌提供新的思路。
　　研究方法：
　　1.了解ST3Gal-Ⅲ在卵巢癌细胞株SKOV3和HO8910PM中的表达差异：qRT-PCR检测HO8910PM、SKOV3细胞株ST3Gal-Ⅲ的基因表达水平，流式细胞术检测在ST3Gal-Ⅲ作用下结合于细胞表面的生物素标记怀槐凝集素MALII的平均荧光强度。
　　2.CCK-8法检测高、低表达ST3Gal-Ⅲ卵巢癌细胞株对紫杉醇的化疗敏感性：CCK-8法检测不同剂量梯度范围内紫杉醇持续作用24h，对比HO8910PM、SKOV3的增殖抑制率及半数抑制浓度（IC50），评估ST3Gal-Ⅲ的表达与卵巢癌细胞株对紫杉醇的化疗敏感性的相关性。
　　3. qRT-PCR检测ST3Gal-Ⅲ siRNA对高表达ST3Gal-Ⅲ的HO8910-PM细胞株的下调效率。4.Western Blot检测先后经ST3Gal-Ⅲ siRNA转染、紫杉醇处理后的不同ST3Gal-Ⅲ表达水平的HO8910PM细胞株caspase家族凋亡蛋白的改变，同时联合显色法TUNEL、FACS法检测各组HO8910PM细胞凋亡效应。探讨唾液酸转移酶抑制剂(ST3Gal-Ⅲ siRNA)联合紫杉醇对HO8910PM细胞株的毒性差异。
　　5. qRT-PCR检测紫杉醇对低表达ST3Gal-Ⅲ的SKOV3细胞株的ST3Gal-Ⅲ mRNA表达的影响:通过比较不同剂量梯度、作用时间紫杉醇诱导低表达ST3Gal-Ⅲ的SKOV3细胞表面的ST3Gal-Ⅲ mRNA表达水平的变化差异，探讨紫杉醇对SKOV3细胞株ST3Gal-Ⅲ表达的影响作用和特征规律。
　　6. qRT-PCR检测先后经紫杉醇、ST3Gal-Ⅲ siRNA处理后的不同处理组的SKOV3细胞ST3Gal-Ⅲ表达。
　　7. Western Blot检测先后经紫杉醇、ST3Gal-Ⅲ siRNA处理后，SKOV3细胞株ST3Gal-Ⅲ表达与 caspase家族凋亡蛋白的相关性，进一步应用显色法 TUNEL、FACS法检测各组SKOV3细胞凋亡效应。研究不同ST3Gal-Ⅲ表达水平的SKOV3细胞株对紫杉醇化疗药物敏感性的差异，探讨ST3Gal-Ⅲ对SKOV3细胞化疗敏感性的影响。
　　结果：
　　1.卵巢癌细胞株SKOV3、HO8910PM的ST3Gal-Ⅲ基因表达水平及细胞表面ST3Gal-Ⅲ表达水平均存在明显差异：qRT-PCR检测证实ST3Gal-Ⅲ mRNA在卵巢癌细胞株SKOV3、HO8910PM中表达存在差异表达（P＜0.05）；流式检测生物素标记怀槐凝集素MALII结合细胞表面的α2，3-唾液酸的表达水平存在显著差异（P＜0.05）；HO8910PM细胞株ST3Gal-Ⅲ表达水平明显高于SKOV3细胞株。
　　2.高、低表达ST3Gal-Ⅲ卵巢癌细胞株的紫杉醇化疗敏感性不同：通过CCK8法检测不同剂量梯度范围内紫杉醇作用SKOV3、HO8910PM细胞株24h的细胞增殖抑制率，高表达的HO8910PM细胞株的增殖抑制率明显低于低表达的SKOV3细胞株，HO8910PM细胞株（IC50=395.078nmol/L）的紫杉醇半数抑制浓度约为SKOV3细胞株的（IC50=130.645nmol/L）的3倍。
　　3.唾液酸转移酶抑制剂能够有效下调HO8910PM细胞株ST3Gal-Ⅲ表达: qRT-PCR检测siRNA组ST3Gal-Ⅲ mRNA的相对表达量为对照组的0.239±0.859倍，两者之间的差异有统计学意义（P=0.000）；经紫杉醇处理后的PTX+siRNA组ST3Gal-Ⅲ mRNA的相对表达量为PTX+non-siRNA组的0.184±0.037倍，两者之间的差异有统计学意义（P=0.000）。
　　4. HO8910PM细胞株先后经ST3Gal-Ⅲ siRNA转染、紫杉醇联合处理后caspase家族凋亡蛋白表达增强，细胞凋亡增加：Western Blot检测结果显示，PTX+siRNA组、siRNA组ST3Gal-Ⅲ蛋白的表达明显低于对照组、PTX组、PTX-non-siRNA组；PTX+siRNA组caspase凋亡蛋白表达明显高于其他对照组组。FACS法、显色法TUNEL检测各组HO8910PM细胞凋亡情况结果与上相同。
　　5.紫杉醇上调SKOV3细胞株ST3Gal-Ⅲ水平：通过不同浓度紫杉醇（0nmol/L、25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L），不同药物处理时间（24h、48h、72h）作用SKOV3细胞株；qRT-PCR检测结果显示紫杉醇作为细胞周期特异性药物，对卵巢癌细胞 ST3Gal-Ⅲ诱导表达存在一定的时间-剂量相关性规律；其中50nmol/L浓度的紫杉醇持续作用48h时诱导SKOV3细胞株表达上调效果最为显著，ST3Gal-Ⅲ mRNA表达量约为对照组的3倍。
　　6. qRT-PCR检测先后经紫杉醇、ST3Gal-Ⅲ siRNA处理后的不同处理组的SKOV3细胞株ST3Gal-Ⅲ表达水平：结果显示 PTX+siRNA组 ST3Gal-Ⅲ mRNA的相对表达量显著低于其余处理组; PTX96h组、PTX+non-siRNA组、PTX48h组紫杉醇药物处理组 ST3Gal-ⅢmRNA的相对表达量均显著高于对照组的基础表达。
　　7. Western blot检测结果显示各组不同ST3Gal-Ⅲ表达水平SKOV3细胞凋亡蛋白表达情况，PTX+siRNA凋亡蛋白表达明显高于对照组、PTX96h、PTX+non-siRNA组。这与FACS法、显色法TUNEL检测各组SKOV3细胞凋亡结果基本一致。
　　结论：
　　1、卵巢癌HO8910PM细胞株表面的ST3Gal-Ⅲ表达水平明显高于SKOV3细胞株。
　　2、低表达ST3Gal-Ⅲ的SKOV3细胞株对紫杉醇更为敏感，而高表达ST3Gal-Ⅲ的HO8910PM细胞株对紫杉醇更为耐受。
　　3、ST3Gal-Ⅲ siRNA联合紫杉醇能够增强HO8910PM细胞株的化疗敏感性。
　　4、低剂量紫杉醇上调卵巢癌SKOV3细胞株ST3Gal-Ⅲ的表达，增强其对紫杉醇的抵抗作用，下调已经增高的ST3Gal-Ⅲ表达可以减弱对紫杉醇的化疗抵抗。
　　5、ST3Gal-Ⅲ降低了卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性，可能通过Caspase途径保护卵巢癌细胞免于药物诱导的细胞凋亡。

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英文摘要

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前言

第一部分卵巢癌细胞ST3Gal-Ⅲ表达与紫杉醇化疗敏感性的相关性研究

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分紫杉醇联合唾液酸转移酶抑制剂增强高表达HO8910PM细胞化疗敏感性

材料和方法

结果

讨论

结论

第三部分紫杉醇诱导低表达ST3Gal-Ⅲ卵巢癌SKOV3细胞株化疗耐药的研究

材料和方法

结果

讨论

结论

全文总结

参考文献

英文缩略词表

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致谢