ClC-3氯通道过表达对小鼠骨骼的影响

摘要

目的：骨的生长代谢由多种因素参与调控，研究表明骨的生长代谢与Ca2+、K+等多种离子通道相关。氯离子通道广泛分布于多种组织，电压门控氯通道家族蛋白成员3（voltage-gated chloride channel family protein3。ClC-3）作为ClC型氯离子家族通道中一种重要的亚型，在成骨细胞和破骨细胞上均有表达并且参与了成骨细胞的骨形成与破骨细胞的骨吸收，提示其与骨代谢有着密切的关系。但目前尚不了解ClC-3氯通道对骨代谢的具体作用及作用机制。本研究以ClC-3过表达小鼠为主要研究对象，观察胫骨松质骨和皮质骨的骨量与骨结构的变化及股骨生物力学的改变，并探讨这些改变的可能因素，以了解小鼠ClC-3氯通道对骨代谢的影响。
　　方法：导入含有CLCN3基因和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的质粒构建ClC-3氯通道过表达的FVB小鼠，鼠尾基因检测确定并选择ClC-3过表达型（ClC-3 transgene）小鼠为主要研究对象。实验主要分为野生型（WT）组和ClC-3过表达型组。每组小鼠从出生开始，每隔一个月测量体重及体长，每组在饲养至一月龄，三月龄，九月龄时分别取雄性和雌性小鼠各10只处死并分离出右侧胫骨和股骨作为实验研究对象。测量胫骨的重量和长度。对胫骨上段（proximal tibial metaphysis，PTM）和胫骨中段（middle part of tibia shaft。TX）进行脱钙，石蜡包埋，切片。切片脱蜡后荧光拍照进一步确认小鼠的基因型。切片HE染色后骨形态计量学分析胫骨上段松质骨的骨量参数即骨小梁面积百分数（percent trabecular area,％Tb.Ar）和骨结构参数即骨小梁数量（trabecular number。Tb.N）、骨小梁宽度（trabecular width。Tb.Wi）和骨小梁分离度（trabecular separation。Tb.Sp）；分析胫骨中段皮质骨的骨组织总面积（total tissue area。T.Ar）、皮质骨面积（cortical area。Ct.Ar）、皮质骨面积百分数（percent cortical area,%Ct.Ar）、骨髓腔面积（marrow area。Ma.Ar）、骨髓腔面积百分数（percent marrow area,%Ma.Ar）的变化。对股骨行三点弯曲骨生物力学测试并分析最大载荷和最大应力的变化。进一步检测比较WT组和ClC-3 transgene组碱性磷酸酶（alkaline phosphatase。ALP）表达的高低。
　　结果：
　　1.转基因小鼠基因检测
　　小鼠经鼠尾DNA检测后确认为野生型或ClC-3过表达型，石蜡切片的荧光拍照图片进一步确认小鼠基因型。成功构建ClC-3过表达小鼠。
　　2. ClC-3过表达对小鼠体重和体长的影响
　　（1）雌性小鼠体重和体长变化
　　随着时间的增长WT组在一月龄至七月龄时体重逐渐增加，八月龄至九月龄时体重大幅增加，ClC-3 transgene组小鼠体重呈现相同趋势。与WT组相比，ClC-3 transgene组小鼠在各月龄中体重均有减轻，且在二月龄和三月龄时其减少有统计学意义（P<0.05）。
　　随着时间的增长WT组在一月龄至九月龄时体长逐渐增加，ClC-3 transgene组小鼠体长呈现相同趋势。与WT组相比，ClC-3 transgene组小鼠在各月龄中体长均有减小，且在二月龄和三月龄时其减少有统计学意义（P<0.05）。
　　（2）雄性小鼠体重和体长变化
　　随着时间的增长WT组在一月龄至七月龄是体重逐渐增加，八月龄至九月龄时体重略有减轻，ClC-3 transgene组小鼠体重呈现相同趋势。与WT组相比，ClC-3 transgene组小鼠在各月龄中体重均有减轻，且在二月龄和三月龄时其减少有统计学意义（P<0.05）。
　　随着时间的增长WT组在一月龄至九月龄时体长逐渐增加，ClC-3 transgene组小鼠体长呈现相同趋势。与WT组相比，ClC-3 transgene组小鼠在各月龄中体长均有减小，且在二月龄至四月龄时其减少有统计学意义（P<0.05）。
　　3. ClC-3过表达对小鼠胫骨重量和长度的影响
　　（1）雌性小鼠胫骨重量和长度变化
　　随着时间的增长WT组胫骨重量在一月龄至七月龄时逐渐增加，八月龄至九月龄时略有减轻。ClC-3 transgene组胫骨重量在一月龄至八月龄时逐渐增加，九月龄时略有减轻。与WT组相比，ClC-3 transgene组小鼠在各月龄中胫骨重量均有减小，且在一月龄至四月龄时其减少有统计学意义（P<0.05）。
　　随着时间的增长WT组胫骨长度在一月龄至九月龄时逐渐增加。ClC-3 transgene组小鼠胫骨长度呈现相同趋势。与WT组相比，ClC-3 transgene组小鼠在各月龄中胫骨长度均有减小，且在一月龄和二月龄时其减少有统计学意义（P<0.05）。
　　（2）雄性小鼠胫骨重量和长度变化
　　随着时间的增长WT组胫骨重量在一月龄至四月龄时逐渐增加，五月龄至九月龄时基本平稳。ClC-3 transgene组胫骨重量在一月龄至九月龄时逐渐增加。与WT组相比，ClC-3 transgene组小鼠在各月龄中胫骨重量均有减小，且在一月龄至四月龄时其减少有统计学意义（P<0.05）。
　　随着时间的增长WT组胫骨长度在一月龄至九月龄时逐渐增加。ClC-3 transgene组小鼠胫骨长度呈现相同趋势。与WT组相比，ClC-3 transgene组小鼠在各月龄中胫骨长度均有减小，且在二月龄和四月龄时其减少有统计学意义（P<0.05）。
　　4. ClC-3过表达对小鼠胫骨上段松质骨影响
　　（1）雌性小鼠胫骨上段松质骨变化
　　WT组骨量参数即%Tb.Ar在一月龄至三月龄中逐渐增大，在九月龄时减小。骨结构参数Tb.Wi及Tb.N在一月龄至三月龄中逐渐增大，在九月龄时减小；Tb.Sp在一月龄至三月龄中逐渐减小，在九月龄时增大。ClC-3 transgene组骨量和骨结构参数呈现相同趋势。与WT组相比，ClC-3 transgene组小鼠各月龄的%Tb.Ar、Tb.Wi和Tb.N均有减小，Tb.Sp均有增大，且ClC-3 transgene组%Tb.Ar在一月龄和三月龄的减少有统计学意义（P<0.05，P<0.01），Tb.Wi在三月龄的减少有统计学意义（P<0.05），Tb.Sp在三月龄的增加有统计学意义（P<0.05）。
　　（2）雄性小鼠胫骨上段松质骨变化
　　WT组骨量参数即%Tb.Ar在一月龄至三月龄中逐渐增大，在九月龄时大幅减小。骨结构参数Tb.Wi及Tb.N在一月龄至三月龄中逐渐增大，在九月龄时减小；Tb.Sp在一月龄至三月龄中逐渐减小，在九月龄时增大。ClC-3 transgene组骨量和骨结构参数呈现相同趋势。与WT组相比，ClC-3 transgene组小鼠各月龄的%Tb.Ar、Tb.Wi和Tb.N均有减小，且ClC-3 transgene组%Tb.Ar在一月龄的减少有统计学意义（P<0.01），在三月龄的减少也有统计学意义（P<0.05）。Tb.Wi在一月龄和三月龄的减少有统计学意义（P<0.05），Tb.Sp在三月龄的增加有统计学意义（P<0.05）。
　　5. ClC-3过表达对小鼠胫骨中段皮质骨影响
　　（1）雌性小鼠胫骨中段皮质骨变化
　　WT组骨量绝对参数即T.Ar和Ct.Ar在一月龄至九月龄时随时间变化逐渐增大；相对参数%Ct.Ar在一月龄至三月龄时逐渐增大，在九月龄时减少；Ma.Ar和%Ma.Ar在一月龄至三月龄时逐渐减少，在九月龄时增加。ClC-3 transgene组骨量参数呈现相同的趋势。与WT组相比，ClC-3 transgene组小鼠各月龄的T.Ar、Ct.Ar和%Ct.Ar均有减少，Ma.Ar和%Ma.Ar均有增加，且T.Ar在三月龄时的变化有统计学意义（P<0.05），Ct.Ar、%Ct.Ar和%Ma.Ar在三月龄和九月龄时的变化有统计学意义（P<0.05），Ma.Ar在九月龄时的变化有统计学意义（P<0.05）。
　　（2）雄性小鼠胫骨中段皮质骨变化
　　WT组骨量绝对参数即T.Ar、Ct.Ar和相对参数%Ct.Ar在一月龄至三月龄时随时间变化逐渐增大，在三月龄至九月龄时基本保持稳定；Ma.Ar和%Ma.Ar在一月龄至三月龄逐渐减小，在三月龄至九月龄时基本保持稳定。ClC-3 transgene组骨量参数呈现相同的趋势。与WT组相比，ClC-3 transgene组小鼠各月龄的T.Ar、Ct.Ar和%Ct.Ar均有减少，Ma.Ar和%Ma.Ar均有增加，且T.Ar在三月龄时的变化有统计学意义（P<0.05），Ct.Ar、%Ct.Ar、Ma.Ar和%Ma.Ar在三月龄和九月龄时的变化有统计学意义（P<0.05）。
　　6. ClC-3过表达对小鼠股骨生物力学的影响
　　（1）雌性小鼠股骨生物力学变化
　　WT组最大载荷在一月龄至三月龄中逐渐增大，在九月龄时减小。ClC-3 transgene组呈现相同的趋势。与WT组相比，ClC-3 transgene组的最大载荷在各月龄均有减少，且在三月龄时其减小有统计学意义（P<0.05）。
　　WT组最大应力在一月龄至三月龄中逐渐增大，在九月龄时减小。ClC-3 transgene组呈现相同的趋势。与WT组相比，ClC-3 transgene组的最大应力在各月龄均有减少，且在三月龄时其减小有统计学意义（P<0.05）。
　　（2）雄性小鼠股骨生物力学变化
　　WT组最大载荷在一月龄至三月龄中增大，在九月龄时减小。ClC-3 transgene组呈现相同的趋势。与WT组相比，ClC-3 transgene组的最大载荷在各月龄均有减少，且在三月龄时其减小有统计学意义（P<0.05）。
　　WT组最大应力在一月龄至三月龄中增大，在九月龄时减小。ClC-3 transgene组呈现相同的趋势。与WT组相比，ClC-3 transgene组的最大应力在各月龄均有减少，且在一月龄和三月龄时其减小有统计学意义（P<0.05）。
　　7. ClC-3过表达对小鼠碱性磷酸酶水平的影响
　　与WT组相比，ClC-3 transgene组碱性磷酸酶水平的表达减少（P<0.05）。
　　结论：ClC-3氯通道过表达明显的影响骨骼的生长发育，表现为小鼠体重、体长、胫骨的长度和重量的改变；特别是松质骨骨小梁骨量的减少和骨结构的破坏；皮质骨骨外膜面骨量减少和骨内膜骨髓腔增大，使皮质骨绝对值和相对值骨量都减少，这些结果影响骨骼的材料力学和结构力学的性能，导致骨质量的降低。骨生物力学结果显示ClC-3氯通道过表达可能对雌性小鼠骨质量影响更大。提示ClC-3参与调节骨骼生长发育及代谢，其机理可能与ClC-3过表达使得成骨细胞功能减弱有关。深入的机理研究有待进一步的探讨。

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1 前言

1.1 骨骼的结构功能及分类

1.2 骨组织的细胞及其研究现状

1.3 骨建造与骨重建

1.4 骨质疏松症及其研究现状

1.5 ClC-3氯通道

1.6 ClC-3氯通道与骨的关系

1.7 本课题的研究思路及目的意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果

3.1 ClC-3过表达转基因小鼠的基因型鉴定

3.2 小鼠胫骨荧光图片

3.3 ClC-3过表达对小鼠体重和体长的影响

3.4 ClC-3过表达对小鼠胫骨长度及重量的影响

3.5 ClC-3过表达对小鼠胫骨上段松质骨的影响

3.6 ClC-3过表达对小鼠胫骨中段皮质骨的影响

3.7 ClC-3过表达对小鼠骨生物力学的影响

3.8 ClC-3过表达对成骨细胞碱性磷酸酶的影响

4 讨论

4.1 实验动物的选择

4.2 骨组织部位的选择

4.3骨组织实验方法的选择

4.4 ClC-3过表达对小鼠体重和体长的影响

4.5 ClC-3过表达对小鼠胫骨松质骨及皮质骨的影响

4.6 ClC-3过表达对骨生物力学的影响

4.7 ClC-3过表达对碱性磷酸酶的影响

5 结论

参考文献

在学期间发表学术论文清单

主要缩略词汇表

致谢