目的：构建携带Pax6基因的重组慢病毒载体，体外转染人骨髓间充质干细胞，将目的基因整合入干细胞内并检测其表达情况，为进一步研究骨髓间充质干细胞定向分化，以及将来视神经病变的干细胞替代治疗提供实验依据。 方法：从人Pax6 cDNA基因克隆载体pGEM-PAX6上PCR扩增Pax6基因片段，将PCR产物及慢病毒载体pHIV-EGFP经XbaI和BamHI双酶切后，以T4连接酶连接，同时设立pHIV-EGFP空载体组作为对照，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，测序鉴定。经293T细胞包装后，收集含病毒颗粒的上清液，标定滴度。以MOI=10、20、40体外转染人骨髓间充质干细胞，显微镜下观察细胞形态，荧光显微镜下观察EGFP表达以判断转染是否成功，Real time PCR检测转染细胞的Pax6表达。 结果：质粒PCR及基因测序证实Pax6基因与pHIV-EGFP慢病毒载体连接成功，包装后获得滴度约为3×106pfu/ml的Pax6-EGFP重组体。转染人骨髓间充质干细胞后，在荧光显微镜下可见绿色荧光，且随培养时间延长，荧光强度未见衰退。Real time PCR提示，被转染细胞内有Pax6基因表达。 结论：成功构建搭载目的基因的慢病毒重组载体Pax6-EGFP，以该病毒将外源基因整合到宿主细胞基因组中，获得过表达Pax6基因的BMSCs，并可利用慢病毒载体系统自带的绿色荧光蛋白直接观察转染及表达情况。
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