海洋生物JNY中蛋白成分的分离纯化及其体外活性初步研究

摘要

从海洋生物中探索生物活性蛋白越来越受到各国科学家的广泛关注。多年来，本课题组一直致力于蚶科海洋生物的相关研究，并从中分离得到多种具有较好体外抗肿瘤作用的蛋白组分和化合物。本文以海洋生物毛蚶（JNY）为研究对象，从中分离得到两个活性蛋白化合物，并对其进行了结构表征和体外活性初步研究。 首先，对JNY活性粗蛋白组分进行初提取，然后综合运用盐析沉淀法、阴离子交换柱、分子筛凝胶柱和疏水柱层析以及RP-HPLC等手段进一步分离纯化，最终获得活性纯蛋白组分。采用Trincine-甘油SDS-PAGE电泳技术分析蛋白的分子量分布；Native-PAGE电泳和RP-HPLC鉴定蛋白的纯度；等电点聚焦电泳用于测定蛋白的等电点和；ESI-MS和Edman降解分别测定分子量大小以及N端氨基酸序列；UV、IR、CD等方法用于表征蛋白结构；活性测试初步研究蛋白的体外活性。 在固液比为1∶3、pH为8.0、PBS浓度为0.03mol/L的提取条件下，将经过匀浆超声离心后的JNY上清液经过硫酸铵二级盐析后，在70～100%饱和度下得到粗蛋白组分JNY-1，通过Bradford法测得其蛋白含量为62.03%。JNY-1经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离获得P1、P2组分，P1组分通过SephadexG50凝胶柱分离，Shim pack VP-ODS、YMC pack phenyl反相高效液相色谱二次制备，得到蛋白化合物PGC，其分子量为15.9720kDa，纯度为98.9%，等电点为9.76。Edman降解法测得PGC的N端35个氨基酸序列为PSVYDAAAQLTADVKKDLRDSWKVIGGDKKGNGVA，经过NCBI数据库对比分析，结合分子量以及UV、IR等蛋白结构表征，确定PGC是来自毛蚶血红蛋白HbI的解聚肽链。本文对其进行结构表征以及体外抗炎实验结果表明。实验结果证明：PGC抑制由LPS刺激的RAW264.7的NO表达的作用，其IC50是9.60±0.71%μg/mL。P2通过Phenyl Sepharose CL-4B疏水柱、VP-ODS反相高效液相色谱分离纯化，得到蛋白组分PHC，其分子量为20.570kDa，纯度为98.0%，等电点为6.83。通过N端测序，发现纯蛋白PHC的N端封闭，无法得到N端氨基酸序列信息。体外抗肿瘤活性研究结果显示，纯蛋白PHC对多种肿瘤细胞株具有显著的增值抑制作用，其中对HT-29和A549肿瘤细胞的IC50值分别为80.53±33.14和391.58±37.73μg/mL。

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