Sox-9基因修饰BMSCs复合骨支架材料构建组织工程椎间盘的实验研究

摘要

目的：本研究利用异种骨制备的脱细胞脱钙骨组织工程复合多孔支架，将传代培养的Sox-9基因修饰后SD大鼠骨髓间充质干细胞种植于其中，并在Ba lb/c裸鼠皮下进行移植，检测细胞支架复合物的理化性能和生物相容性，探讨其成为组织工程椎间盘的可行性，为椎间盘组织工程的研究提供实验依据。
　　方法：（1）复苏Sox-9基因修饰的SD大鼠骨髓间充质干细胞，采用常规办法对其进行传代培养，倒置显微镜下观察细胞形态。同时将已经制作成型的骨支架消毒，放入无菌的24孔板中，将已经进行过脱壁处理的基因修饰骨髓间充质干细胞接种于支架上，体外培养48小时，倒置显微镜、扫描电镜、组织学染色观察细胞在支架上的粘附情况。（2）细胞支架复合物体外培养2天后，分实验侧和对照侧将其植入Balb/c裸鼠背部皮下。体内培养2月后，肉眼观察裸鼠背部植入部位情况；处死裸鼠，取出细胞支架复合物，行冰冻切片，扫描电镜、组织学染色观察细胞在支架上的生长情况，行 II型胶原免疫组化染色。qRT-PCR技术检测支架中骨髓间充质干细胞的So x-9基因、II型胶原表达水平。
　　结果：（1）镜下Sox-9基因修饰SD大鼠骨髓间充质干细胞呈长梭形，在第3代开始出现衰老的形态表现；细胞接种支架后，倒置相差显微镜下、扫描电镜、HE染色观察骨髓间充质干细胞在支架上粘附良好。（2）细胞支架复合物体内培养2月后，肉眼观察在裸鼠皮下植入部位周围无感染及炎症反应，细胞支架复合物呈楔形，与皮肤内面愈合。II型胶原免疫组化染色阳性，qRT-PCR检测实验侧支架复合物中骨髓间充质干细胞的Sox-9基因、II型胶原表达水平比对照侧高。P<0.01，△P>0.05，有统计学意义。
　　结论：（1）使用静态接种技术构建骨支架材料与基因转染BMSCs的复合体，可以实现细胞黏附于骨支架并在骨支架内增殖；（2）体外构建的细胞支架复合物在裸鼠皮下培养的方法得到的产物，经检测证实细胞仍能够稳定表达Sox-9目的基因和II型胶原，支架材料仍大部分存在，产物较体外培养更接近类软骨组织。

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前言

第一部分 基因修饰BMSCs传代培养与接种骨支架后的生物相容性评估

1实验材料

1.1支架材料与细胞株

1. 2主要试剂及耗材

2实验方法

2.1基因转染BM SCs复苏、培养及传代

2.2 基因转染BM SCs细胞生长曲线的绘制

2.3 种子细胞与支架材料共培养

2.4细胞支架复合物组织学染色

2.5细胞支架复合物扫描电镜观察

3.实验结果

3.1基因转染BM SCs培养及传代

3.2基因修饰BM SCs细胞生长曲线的绘制

3.3细胞支架复合物组织学检测

3.4基因转染BM SCs细胞支架复合物扫描电镜检测

第二章 细胞支架复合物种植裸鼠皮下体内培养的实验研究

1实验材料

1.1 实验动物

1. 2主要试剂及耗材

1. 3主要仪器

2实验方法

2.1 裸鼠皮下植入实验

2.2 细胞支架复合物HE染色

2.3 II型胶原免疫组织化学染色

2.4 细胞支架复合物扫描电镜观察

2.5细胞支架复合物qRT-PCR检测

2.6 统计学检验

3.实验结果

3.1 裸鼠及细胞支架复合物观察情况

3.2细胞支架复合物组织学及II型胶原免疫组化检测

3. 3细胞支架复合物扫描电镜检测

3. 4细胞支架复合物qRT-PCR检测

讨论

结论

参考文献

文献综述

附录1 主要中英文对照表

附录2 发表论文和参加科研情况

致谢