氧化固醇结合蛋白相关蛋白4L(ORP4L)在巨噬细胞中维持钙离子依赖的Bcl-XL表达

摘要

巨噬细胞在动脉粥样硬化病理过程中发挥重要的作用。动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，它是由白血球尤其是单核细胞过量沁入血管壁慢慢形成的病理过程。在这个过程中，巨噬细胞凋亡是动脉粥样硬化形成和发展的中心事件。
　　ORP4L是氧化固醇结合蛋白家族的一员。越来越多的研究表明，ORP4L不仅仅在脂类代谢中起作用，而在细胞增殖分化甚至生长凋亡方面，有着至关重要的作用。IP3/ Ca2+在细胞增殖方面有着重要作用。IP3激活 IP3R，释放钙库内的Ca2+，当内质网的钙释放到一定水平时，就会启动钙离子释放激活钙离子通道以维持Ca2+内流，从而介导了细胞的增殖生长。我们的研究发现，从ORP4L敲除小鼠中分离的小鼠的腹腔巨噬细胞中PLCβ3活性降低，IP3的产生和内质网钙离子的释放会受到抑制；与之相反的是，在过表达 ORP4L的RAW264.7细胞中PLCβ3活性升高，IP3的产生和内质网钙离子的释放会上升。
　　分离小鼠的腹腔巨噬细胞与野生型小鼠巨噬细胞，并用定量反转录酶-聚合酶链锁反应（qRT-PCR）和 Western blotting检测发现 ORP4L-/-基因敲除鼠的腹腔巨噬细胞 Bcl-XL mRNA与蛋白含量都明显低于野生型鼠的巨噬细胞。用相同的方法检测在过表达 ORP4L的RAW264.7细胞中Bcl-XL含量明显升高。因此ORP4L在巨噬细胞中调控Bcl-XL的表达。
　　Bcl-XL的水平是通过cAMP反应元件结合蛋白（CREB）通路进行调节的。而CREB的激活是通过钙离子依赖的蛋白激酶使其ser-133磷酸化。离子霉素能够使ORP4L沉默的RAW264.7细胞中 Bcl-XL恢复到正常水平。用特异的钙离子螯合剂 BAPTA-AM作用于RAW264.7细胞能阻断由过表达 ORP4L引起的Bcl-XL表达的上调。使用 CREB抑制剂—KG501可以抑制由ORP4L过表达引起的Bcl-XL表达的上升，从而进一步验证Bcl-XL的表达是通过钙离子依赖的CREB通路调控的。在C5a或者SDF-1的刺激下，Bcl-XL在野生型小鼠巨噬细胞中的表达显著地上调，但是在 ORP4L敲除小鼠中，却得到相反的结果。最后，ORP4L缺失促进巨噬细胞凋亡，ORP4L过表达抑制凋亡诱导剂诱导的巨噬细胞凋亡。综上所述，这些数据表明了ORP4L通过钙离子依赖的CREB通路维持了Bcl-XL的表达水平，促进巨噬细胞的生存。揭示ORP4L在巨噬细胞的凋亡机制。为ORP4L在动脉粥样硬化病理过程中发挥重要地作用提供理论依据。

目录

声明

第一章 前言

1.1 动脉粥样硬化

1.2 氧化固醇

1.3 氧化固醇结合蛋白家族

1.4 ORP4L的结构和功能

1.5 Bcl-XL抗凋亡蛋白

1.6 ORP4L与Ca2+释放

1.7 研究目的、意义与创新点

第二章 实验材料、实验仪器与试剂

2.1 实验材料

2.2 实验仪器

2.3 主要试剂配制

3.1 巨噬细胞Ca2+信号检测相关实验

3.2 ORP4L调控Bcl-XL相关实验

第四章 实验结果及分析

4.1 ORP4L在巨噬细胞中介导Ca2+释放

4.2 ORP4L调控Bcl-XL蛋白表达

4.3 ORP4L调控Bcl-XL表达依赖钙离子信号通路

4.4 ORP4L调控Bcl-XL表达依赖CREB

4.5 ORP4L通过介导Ca2+释放调控Bcl-XL蛋白表达

第五章 讨论

参考文献

附录

致谢