利用微流控芯片技术体外建立一种新型的神经血管单元模型

摘要

目的：神经血管单元体外模型能够更科学地模拟神经元-星形胶质细胞-脑微血管内皮细胞在体内的真实结构和生理功能。目前国内外所建立的神经血管单元体外模型无法实现以星形胶质细胞为桥梁，将神经元-星形胶质细胞-脑微血管内皮细胞在同一立体空间或平面内肩并肩进行生长。我们利用微流控芯片技术和细胞培养技术在芯片内成功建立了神经元-星形胶质细胞-脑微血管内皮细胞直接接触生长体外共培养模型。
　　方法：
　　(1)设计一种贯通三通道神经血管单元的体外共培养微流控芯片，并表征三通道共培养时的流速比；(2)分别鉴定神经元、星型胶质细胞、脑微血管内皮细胞的纯度，并绘制三要素细胞单种培养时细胞的生长曲线图；(3)摸索所建立的神经血管单元体外模型三细胞共培养时的接种细胞密度、接种时间、接种顺序和接种方式，并用免疫荧光染色观察了三种要素细胞的生长情况；(4)采用重复测量方差分析分别比较神经元、星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞共培养和单独培养的细胞活力有无差异，采用 SPSS13.3统计软件进行统计分析。
　　结果：
　　(1)芯片内三个主流道的长度均为1 cm，高度均为45μm，中间主流道的宽度为570μm，两侧主流道的宽度均为500μm。流道间孔径的长度均为30μm，宽度和高度均为10μm，孔径的间距均为15μm，进样流速比值为5:6:5；(2)三种要素细胞的纯度均＞95％，神经元的生长经过0-4天的潜伏期，4-10天内进入指数增长期，10天后进入平台期。星形胶质细胞的生长经过1天的潜伏期，1天后进入指数增长期，5天后进入平台期。脑微血管内皮细胞的生长经过1天的潜伏期，1天后进入指数增长期，4天后进入平台期；(3)新型神经血管单元体外模型培养时的神经元、星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞接种密度分别为5~10×106个/ml、3~8×105个/ml、1~5×105个/ml；接种顺序为神经元→星形胶质细胞→脑微血管内皮细胞；接种时间为先前接种的细胞进入指数增长期后接种下一种细胞；接种方式采用重力进样方式，并且每次封闭非进样的两条流道。免疫荧光染色观察到星形胶质细胞为桥梁连接神经元、脑微血管内皮细胞的肩并肩生长；(4)神经元、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞各自的细胞活力在所构建的模型中共培养和各自单种培养进行比较，细胞活力均无统计学差异。
　　结论：
　　我们利用微流控芯片技术成功构建了一种新型的神经血管单元模型，在此模型中三种要素细胞拥有较高的细胞活力。新型的神经血管单元模型中三种要素细胞以星形胶质细胞为桥梁在同一平面肩并肩生长，能更好地模拟体内细胞所处的微环境，有利于细胞间相互作用、信号传导和信息交流的研究。

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第 一 章 前 言

1.1 神经血管单元的概念、构成和功能

1.2神经血管单元体外模型构建的研宄历程及其局限性

第 二 章 神 经 血 管 单 元 共 培 养 芯 片 的 设 计 与 制 作

2 .1神经血管单元共培养芯片设计

2.2神经血管单元共培养芯片模板的制作

2.3神经血管单元共培养芯片的制作

2.4芯片预处理

第 三 章 神 经 血 管 单 元 三 种 要 素 细 胞 的 生 长 特 点

3.1材料和设备

3.2BALB/C小鼠神经元芯片内的生长特点

3.3BALB/C小鼠星形胶质细胞芯片内的生长特点

3.4 bEnd.3细胞系芯片内的生长特点

第 四 章 芯 片 内 神 经 血 管 单 元 三 细 胞 共 培 养 模 型 构 建 与 评 估

4.1材料和设备

4.2芯片内神经血管单元三细胞共培养模型的建立

4.3芯片内神经血管单元三细胞共培养的免疫荧光染色鉴定

4.4芯片内培养三种要素细胞的细胞活力测定

第 五 章 讨 论 与 展 望

5.1构建神经血管单元体外共培养模型的必要性

5.2所构建的神经血管单元体外共培养模型的优势

5.3构建神经血管单元体外共培养模型的应用价值

5.4所构建的神经血管单元体外共培养模型的局限性

5.5神经血管单元体外共培养模型的未来需求和研究方向

参考文献

缩略词中英文对照表

附录

致谢