多功能纳米粒子对非小细胞肺癌靶向诊疗一体化的实验研究

摘要

目的： 本文通过合成对非小细胞肺癌（NSCLC）靶向成像与治疗的多功能纳米体系cRGD-PLGA-SPIO@DOX，运用IVIM-DWI-MRI技术准确监测肿瘤治疗效果，并利用免疫组织化学、Western blotting等方法，从mRNA和蛋白、细胞和动物模型等多个水平进一步深入探讨该多功能纳米粒子对NSCLC的作用机制，为NSCLC的一体化诊断与治疗提供新的理论基础及临床思路。 方法： 1、构建NSCLC靶向诊疗一体化纳米体系cRGD-PLGA-SPIO@DOX，并通过透射电子显微镜、纳米粒度仪、傅里叶变换红外光谱仪、核磁共振分析等方法表征其形貌、粒径、结构等；并检测不同pH环境下纳米体系的药物释放性能；进一步通过红细胞溶血实验检测其是否存在溶血现象。 2、体外细胞部分：通过MTT法、细胞吸收及靶向封闭吸收实验、流式细胞计量术、细胞ROS水平检测等方法分析cRGD-PLGA-SPIO@DOX对人非小细胞肺癌（A549）的抗肿瘤作用及作用机制。 3、体外、体内MRI成像部分：通过临床型MR(GE1.5T Signa HDxt)检测SPIO、cRGD-PLGA-SPIO@DOX的T2弛豫性能和体外细胞T2成像；构建A549细胞裸鼠移植瘤模型，待瘤体体积达到约500mm3（长径约10~12mm），进一步比较分析不同纳米体系在体内的MR成像性能。 4、体内动物部分：构建A549细胞裸鼠移植瘤模型，给药后绘制肿瘤生长-时间曲线。通过Ki67、CD31、Cleaved-Caspase-3等免疫组化检测进一步评估纳米药物作用效果及机制；通过心、肝、脾、肺、肾各脏器的H&E染色及血液生化指标测试等方法评估纳米体系的药物毒性作用。通过大鼠多点动态取样法分析对比DOX和cRGD-PLGA-SPIO@DOX的体内药代动力学差异。 5、IVIM-DWI-MRI动态评估纳米体系疗效：各组裸鼠在给药前、给药后3天、7天、14天和24天进行IVIM-DWI-MRI扫描，通过AW2.0工作站后处理得到标准ADC值、D值、D*值、f值等参数，并通过Pearson相关分析检测IVIM参数与免疫组化技术的相关关系，以及IVIM参数早期相对变化值（7天）与肿瘤体积在24天相对变化的相关关系。 结果： 1、cRGD-PLGA-SPIO@DOX平均粒径是277nm，Zeta电位为25.7mV，电镜下呈分散性好、大小均一的圆球纳米体系。该纳米体系具有良好的pH响应性释放性能，在红细胞溶血实验中证实纳米体系没有发生溶血现象。 2、cRGD-PLGA-SPIO@DOX（IC50为0.2μM）增加了单独DOX（IC50为0.41μM）对A549细胞的杀伤作用；同时该纳米体系（IC50为6.2μM）减小了DOX（3μM）对正常成纤维细胞NIH-3T3细胞的毒性，安全系数比DOX增加了2倍。相比单独DOX，cRGD-PLGA-SPIO@DOX具有更好的A549细胞吸收效率。1μM的cRGD-PLGA-SPIO@DOX诱导A549细胞凋亡比例（36.2%）大于相同浓度的DOX（27.1%），并且1μM浓度的纳米体系导致A549细胞内ROS累积量（170%）大于相同浓度DOX。 3、cRGD-PLGA-SPIO@DOX具有良好的T2弛豫性能（弛豫率达到93mM-1S-1），体内动物成像显示，cRGD-PLGA-SPIO@DOX具有更好的T2成像性能，体内纳米体系注射后1h、4h、24h的T2信号降低百分比分别为-43.9%、-38.3%、-17.3%，均低于SPIO组（P＜0.005）。 4.、cRGD-PLGA-SPIO@DOX2mg/kg组肿瘤体积、重量明显低于对照组以及单独DOX2mg/kg组(P＜0.05)，并且扭转了单独DOX出现的明显体重下降、腹泻、多器官损伤等毒副作用；cRGD-PLGA-SPIO@DOX2mg/kg组中CD31阳性染色率（平均值为18.8%，P＜0.001）、Ki67阳性染色率（平均值为41.9%，P＜0.05）明显低于其他各组，Cleaved-Caspase-3阳性染色高于其他各组。cRGD-PLGA-SPIO@DOX在血浆中的浓度明显高于单独DOX，在48小时时血浆浓度为602μg/L，为DOX浓度的6倍，同时纳米体系明显延长了DOX在体内的半衰期同时降低了体内清除率。 5、双指数模型的多b值IVIM-DWI的D*值、f值可以较好作为肿瘤微循环的影像学生物标志物，例如：D*值、f值与CD31具有明显的线性关系（r2=0.71,P＜0.001；r2=0.66,P＜0.001）；D值可以较好的作为肿瘤细胞密度、活性的影像学生物标志物，例如：D值与Ki67具有很好的线性关系（r2=0.69,P＜0.001）。并且，IVIM-DWI，可以区分肿瘤内微循环灌注、细胞密度和活性的变化，揭示纳米体系抗肿瘤的部分机制，例如：在对照组中，主要是D*值、f值上升，而D值变化不明显，即肿瘤血流灌注持续上升，肿瘤细胞密度和活性未见降低。②在DOX2mg/kg组、cRGD-PLGA-SPIO@DOX1mg/kg组中，D、D*值、f值均缓慢升高，即肿瘤血流灌注持续缓慢上升，肿瘤细胞密度和活性缓慢持续降低。③在cRGD-PLGA-SPIO@DOX1mg/kg组，主要是D值上升，而D*值、f值变化不明显，即肿瘤血流灌注未见持续上升，肿瘤细胞密度和活性持续降低。最后，通过IVIM-DWI测量分析，可以在肿瘤形态学变化之前，早期预测纳米药物的抗肿瘤效果，例如：D值在7天的变化值与最终肿瘤体积变化值存在明显的线性关系（相关系数r2=0.75，P＜0.001）。 结论： 本研究成功构建靶向NSCLC的多功能诊疗一体化纳米体系；首次应用IVIM-DWI技术实现从水分子弥散、微循环灌注功能成像对靶向纳米体系抗肿瘤疗效的无创、动态、定量监测；并从体外、体内探讨了纳米体系抗肿瘤的作用机制，为下一步新型靶向纳米体系在肿瘤诊疗一体化的应用提供了理论依据。

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