自愿运动通过多巴胺D1受体信号通路调节GSK3β促进成年神经发生和认知功能

摘要

目的： 适当运动可以改善老年人的认知功能，例如陈述性记忆，长时程记忆等，并能够改善脑的能量代谢，避免大脑随老化而萎缩，保持脑容量，这些都可能是运动降低阿尔茨海默病发病风险的原因。进一步的研究指出，成年哺乳动物脑内神经发生在运动促进认知改善的过程中起到了关键作用，且在海马区齿状回表现的尤为明显。而海马区齿状回的成年神经发生是一个受到各种神经递质和神经激素精细调节的过程，糖原合酶激酶3β（GSK3β）则是这个过程中的一个关键节点。本课题的目的在于研究GSK3β在自愿运动促进学习记忆功能中发挥的作用，并进一步探索其中的分子机制。 方法： 1，自愿运动对GSK3β的影响 （1）用C57小鼠在转轮鼠笼内建立自愿运动小鼠模型，实验分组为：对照组，自愿运动组。（2）水迷宫实验检测两组小鼠的学习记忆能力。（3）Western blot法检测两组小鼠脑内的GSK3β表达和磷酸化水平。（4）免疫组化法检测GSK3β在海马区的分布和表达。 2，GSK3β在自愿运动促进学习记忆过程中发挥的作用 （1）用海马注射方法在小鼠海马内分别注射人工脑脊液（ACSF）和SB216763。分组为：对照组，自愿运动+ACSF（RW+ACSF），自愿运动+SB216763（RW+SB），并利用转轮小鼠笼盒和普通小鼠笼盒进行造模。（2）水迷宫实验方法比较三组小鼠的学习记忆能力。（3）利用免疫组化法检测三组小鼠海马区的新生神经元标记蛋白DCX和NeuroD的表达和分布情况；免疫荧光发检测三组小鼠海马内Brdu的表达和分布情况.（4）利用western blot法检测三组小鼠海马内的认知相关的调节蛋白CREB的总量和其磷酸化的表达情况。（5）利用免疫荧光法检测三组小鼠海马区内GSK3β和Ser9与新生神经元标记蛋白DCX的共定位情况。 3，由自愿运动激活并影响GSK3β的信号通路 （1）利用western blot法检测各组小鼠海马区内的胰岛素信号通路，IRS-1/PI3K/Akt信号通路的表达和活性水平；免疫组化法检测IRS-1在三组小鼠海马内的分布和表达水平；免疫荧光发检测IRS-1与DCX的共定位。（2）利用ELISA检测法，检测三组小鼠脑内的AMP/ATP的变化；western blot方法检测AMPK表达水平和磷酸化水平的改变。（3）利用ELISA检测法，检测各组小鼠海马内cAMP的含量改变；western blot法检测多巴胺D1受体（dopamine receptor D1，DARP D1）信号通路，DARP D1/cAMP/PKA信号通路和DARP D1/RhoA的改变；免疫组化法检测海马内多巴胺D1受体的分布；免疫荧光检测多巴胺D1受体与DCX的共定位。 结果： 1，自愿运动对GSK3β的影响 1.1 水迷宫结果显示，在自愿运动组小鼠中，7天训练实验的空间探索潜伏期从第三天开始开始优于对照组小鼠，在最后一天定位巡航实验中，自愿运动组小鼠的探索轨迹和目标象限停留时间百分比较对照组有明显的提高（p＜0.05）。 1.2 western blot和免疫组化结果显示，相对于对照组小鼠，自愿运动组小鼠海马的GSK3β表达水平明显升高（p＜0.01），磷酸化抑制位点Ser9的表达水平明显降低（p＜0.01），磷酸化激活位点Tyr216的表达水平明显升高（p＜0.01）。 2，GSK3β在自愿运动促进学习记忆过程中发挥的作用。 2.1 水迷宫结果显示，在RW+ACSF组小鼠中，7天训练实验的空间探索潜伏期从第三天开始开始优于对照组小鼠，在最后一天定位巡航实验中，自愿运动组小鼠的探索轨迹和目标象限停留时间百分比较对照组有一定程度的提高（p＞0.05）；在RW+SB组小鼠中，7天训练训练实验的空间探索潜伏期要略劣于RW+ACSF组，最后一天的定位巡航实验中，RW+SB组小鼠的探索轨迹和目标现象停留时间百分比要明显劣于RW+ACSF组（p＜0.01）。 2.2 wester blot结果显示，三组小鼠海马内的CREB表达水平没有明显差异，p-CREB表达水平在RW+ACSF组中较对照组有明显的提高（p＜0.01），在RW+SB组又发生了明显的下降（p＜0.01）。 2.3 免疫组化结果显示，在RW+ACSF组小鼠海马区内DCX，NeuroD和Brdu的表达水平较对照有明显的升高（p＜0.01），而RW+SB组小鼠较RW+ACSF组NeuroD有一定程度的下降（p＞0.05），DCX和Brdu有明显的降低（p＜0.01）。 2.4 免疫荧光结果显示，在各组小鼠的海马区内DCX与GSK3β具有高度一致的改变，且GSK3β可以和DCX完全共表达；而Ser9与DCX具有完全相反的变化趋势，且Ser9与DCX无法完全共表达。 3,由自愿运动激活并影响GSK3β的信号通路。 3.1 western blot结果显示，在RW+ACSF组小鼠中，胰岛素信号通路中的IRS-1、PI3K、Akt信号分子的活性水平都有非常明显的提高（IRS-1、PI3K中p＜0.01；Akt则p＜0.05），但是GSK3β的表达和活性都明显提高（p＜0.01）；在RW+SB组小鼠中，较RW+ACSF组都有不同程度的下降，GSK3β的活性明显降低（p＜0.05）。免疫组化结果显示，p-IRS-1在RW+ACSF组小鼠海马内的分布较对照组小鼠有明显的提高（p＜0.01）；在RW+SB组小鼠中，p-IRS-1的分布较RW+ACSF组有明显的下降（p＜0.05）。免疫荧光的结果显示，IRS-1与DCX在各组小鼠的海马内有高度一致的表达变化，但是DCX与IRS-1完全不共表达。 3.2 ELISA检测的结果显示，在RW+ACSF组小鼠的海马内，AMP/ATP的比值有非常显著的提高（p＜0.01）；在RW+SB组小鼠中，该比值较RW+ACSF组小鼠有一定程度的下降（p＞0.05）。western blot结果显示，三组小鼠的AMPK表达水平在RW+ACSF组中有明显升高（P＜0.05）；RW+SB与RW+ACSF组没有差异；而p-AMPK在RW+ACSF组小鼠中较对照组有非常明显的提高（p＜0.01），且RW+SB组较RW+ACSF组有一定程度的下降。 3.3 ELISA检测结果显示，在RW+ACSF组小鼠中，cAMP的含量较对照组有明显的提高（p＜0.05）；RW+SB较RW+ACSF组小鼠有一定程度的下降（p＞0.05）。western blot结果显示，在多巴胺D1受体信号通路中的DARP D1、RhoA、PKA信号分子的活性在RW+ACSF组小鼠中有明显的提高（p-RhoA中p＜0.05；PKA-RI则p＜0.01）且GSK3β的活性和表达也都发生了明显的提高（p＜0.01）；在RW+SB组中，相对于RW+ACSF组都有不同程度的下降，且GSK3β的活性也明显降低（p＜0.01）。免疫组化结果显示，DARP D1的表达和分布在RS+ACSF组中有明显的提高（p＜0.05）；RW+SB组相较于RW+ACSF组则有一定程度的降低（p＞0.05）。免疫荧光结果显示，DARP D1与DCX在三组小鼠的海马内具有高度一致的变化，且有部分DARP D1可以与DCX完全共表达，另有部分DARP D1完全不于DCX共表达。 结论： 1，自愿运动可以增强认知能力和海马区齿状回的成年神经发生； 2，自愿运动促进成年神经发生改善认知能力过程中，GSK3β的表达和活性水平都会明显提高； 3，自愿运动可以促进胰岛素信号通路的激活，但其不是运动促进神经发生过程中调节GSK3β表达和活性的主要机制。 4，多巴胺D1受体信号通路可以在自愿运动后激活，且可能是自愿运动促进成年神经发生改善学习记忆过程中，调节GSK3β表达和活性改变的主要机制。

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