具骨生物响应性水溶性壳聚糖衍生物的合成及细胞学性能

摘要

壳聚糖作为一种无毒、无害、生物相容性良好的材料被广泛应用于医用生物材料领域，同时壳聚糖可进行多种本体改性，改性后的材料具有更加优越的生物学性能。目前骨修复材料面临诸多挑战，材料能否与宿体间特异性结合显得尤为重要。为此，本研究重在构建在不同位点修饰的具有骨生物响应性壳聚糖衍生物材料并对其进行细胞学性能研究。 本研究首先合成了两种改性壳聚糖材料——2-N-磷酸化壳聚糖（NPCS）和6-O-磷酸化壳聚糖（OPCS），并以前成骨细胞MC3T3-E1s为靶细胞，研究这两种改性壳聚糖材料对前成骨细胞MC3T3-E1s的增殖、分化以及相关成骨基因表达水平方面的影响。基于以上的研究，我们得到了促进细胞成骨分化的最佳改性材料。同时，为了研究改性材料对组织修复血管化的影响，我们也合成出来了另一种改性材料——磺化壳聚糖（SCS），以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为靶细胞，在增殖、分化以及基因水平进行研究。在研究的过程中我们也在探索另一种双功能化改性材料——磷酸化磺化壳聚糖（PSCS），研究其对两种靶细胞在增殖、分化以及基因水平的影响。研究结果表明： （1）与纯的壳聚糖材料相比，两种磷酸化后的壳聚糖材料对前成骨细胞的细胞增殖、分化以及基因表达方面均有一定的促进作用，同时在这两种不同磷酸化的壳聚糖材料中比较，则发现2-N-磷酸化壳聚糖（NPCS）对细胞的成骨分化促进作用更大。 （2）与空白及肝素材料相比，磺化壳聚糖对血管化形成有一定的促进作用。同时在各磺化壳聚糖内部之间也进行了比较，发现不同的磺化壳聚糖对细胞的影响作用也不相同。通过比较，筛选出了对细胞影响效果最好的一种磺化壳聚糖，即2,6-SCS。 （3）磷酸化磺化壳聚糖具备与前成骨细胞及内皮细胞双特异性响应，具有磷酸化壳聚糖与磺化壳聚糖的各自优点，不仅能促细胞成骨分化，也能促进血管化形成。

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第一章 绪论

1.1 骨修复材料的研究现状

1.2壳聚糖（CS）在骨修复中的研究现状及分析

1.3磷酸化壳聚糖的研究现状

1.4磺化壳聚糖的研究现状

1.5研究思路与方案

第二章 不同位点磷酸化壳聚糖衍生物的合成及细胞学评价

2.1 引言

2.2主要试剂与仪器

2.3 试验方法

2.3.1 2-N磷酸化壳聚糖（NPCS）材料的制备

2.3.2 3,6-O磷酸化壳聚糖（OPCS）材料的制备

2.3.4 前成骨细胞MC3T3-E1s的培养与种植方法

2.3.5 细胞增殖测试

2.3.6 激光共聚焦细胞骨架观察

2.3.7 碱性磷酸酶定量、定性检测

2.3.8 茜素红钙结节染色

2.3.9 材料对细胞MC3T3-E1s中成骨相关基因的影响

2.3.10 统计学分析

2.4 结果与讨论

2.4.1 磷酸化壳聚糖材料的表征

2.4.2 细胞的增殖

2.4.3激光共聚焦观察细胞骨架及形貌

2.4.4碱性磷酸酶定性定量检

2.4.5 茜素红钙结节染色

2.4.6 细胞的基因表达

2.5 结论

第三章 磺化壳聚糖的合成及对HUVECs行为的影响

3.1 引言

3.2 主要试剂与仪器

3.3 试验方法

3.3.1 磺化壳聚糖（SCS）材料的制备

3.3.2 磺化壳聚糖材料的表征

3.3.3 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的培养与种植方法

3.3.4 细胞增殖测试

3.3.5 SCS对HUVECs行为的影响

3.3.6 不同材料对HUVECs相关基因表达情况的影响

3.3.7 不同材料对HUVECs作用后的Western blot检测

3.3.8 统计学分析

3.4 结果与讨论

3.4.1 磺化壳聚糖材料的表征

3.4.2 细胞的增殖与形态

3.4.3 SCS对HUVECs行为的影响

3.4.4 不同材料对细胞HUVECs中的相关基因的影响

3.4.5 western blot的检测结果分析

3.5结论

第四章 不同壳聚糖衍生物对MC3T3-E1s与HUVECs共培养的影响

4.1 引言

4.2 主要试剂与仪器

4.3 试验与方法

4.3.1 磷酸化磺化壳聚糖（PSCS）的制备

4.3.2 PSCS的表征

4.3.3 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的培养与种植方法

4.3.4 细胞增殖测试

4.3.5 材料对细胞HUVECs中的相关基因的影响

4.3.6 PSCS材料对HUVECs作用后的Western blot检测

4.3.7 不同材料对内皮细胞（HUVECs）和前成骨细胞（MC3T3-E1s）的共培养研究

4.3.8 统计学分析

4.4结果与讨论

4.4.1 磺化壳聚糖材料的表征

4.4.2 细胞的增殖

4.4.3 PSCS对HUVECs行为的影响

4.4.4 材料对细胞HUVECs中的相关基因的影响

4.4.5 western blot的检测结果分析

4.3.6 不同材料对内皮细胞和成骨细胞共培养的影响研究

4.5结论

全文总结

5.1 主要结论

5.2 论文特色与创新性

5.3 存在问题与展望

参考文献

致谢