DEHP降解菌的分离及其与玉米联合修复受污染土壤

摘要

邻苯二甲酸酯（Phthalic acid esters，PAEs）一类被广泛用作塑料增塑剂、农药载体等行业的有机化合物。但PAEs具有生殖毒性、神经毒性等，是一类典型的环境内分泌干扰物。由于工农生产和生活使用尤其是地膜覆盖和塑料大棚的推广应用，导致农业土壤普遍受PAEs污染，严重影响土壤质量和农产品质量安全。研发PAEs污染土壤的修复技术备受关注。目前微生物修复被视为环境中PAEs降解的主要途径，而植物修复是环境友好的经济型技术，结合二者优势可形成有效的生物修复技术。本研究以土壤中检测率和含量均较高的PAEs典型化合物邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Di(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP）为目标污染物，采用气相色谱串联质谱联用仪（GC-MS）和高效液相色谱飞行时间质谱联用仪（LC-TOF-MS/MS）分析，从活性污泥中分离得到DEHP高效降解菌，并进行菌种鉴定；测定单因素条件下菌株对DEHP的降解效率，并利用响应曲面法优化菌株降解DEHP的最佳条件；鉴定菌株对DEHP的降解产物并反向验证菌株对DEHP的关键降解酶基因，综合分析其降解途径；然后通过土壤盆栽玉米（Zea mays）试验，研究玉米接种高效降解菌对DEHP污染土壤的修复效果及降解菌缓解DEHP胁迫对玉米生长的影响，为PAEs污染土壤修复及保障农产品安全提供科学依据。主要研究结果如下： （1）降解菌的筛选与鉴定：以PAEs混合物为受试污染物，利用浓度梯度驯化法，从活性污泥中分离筛选出一株DEHP降解菌。根据细菌的形态学特征、生理生化特性以及16S rDNA序列同源性分析鉴定，确定为嗜吡啶红球菌（Rhodococcus pyridinivorans XB）。 （2）单因素降解试验及优化降解条件：通过单因素降解试验，研究温度、pH、接菌量等单因素条件下菌株降解DEHP的影响，发现温度为25~35℃，pH为6~8是相应的最优降解率区间，接菌量无明显差异；采用响应面曲线优化条件发现，菌株对DEHP的最佳降解条件为：温度为30.4℃、pH为7.08、接菌量为1.0（OD600），其拟合2d降解率为98.5%，实际降解率为99.1%。菌株XB在120h内可将不同初始浓度（50~400mg·L-1）的DEHP完全降解，并于72h对800mg·L-1的DEHP降解率达88.3%。不同浓度DEHP（50~800mg·L-1）降解半衰期为5.44~23.48h。 （3）降解途径分析：采用LC-TOF-MS/MS分析DEHP降解中间产物，并利用实时荧光定量PCR技术反向验证菌株XB降解酶基因，综合推测其降解途径。首先，菌株XB分泌羧酸酯键水解酶先后断裂DEHP两侧酯键，DEHP转化为邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（Monoethylhexyl phthalate，MEHP），MEHP继而转化为邻苯二甲酸（Phthalic Acid，PA）。PA在邻苯二甲酸4,5-双加氧酶作用下转化为4,5-二羟基邻苯二甲酸。菌株再通过脱羧基反应使4,5-二羟基邻苯二甲酸转化为原儿茶酸（Protocatechuic acid，PCA）。之后PCA经菌株的原儿茶酸3,4-α亚基双加氧酶和原儿茶酸3,4-β亚基双加氧酶基因表达转化为小分子有机酸，最后通过三羧酸循环分解为CO2和H2O。 （4）菌株XB降解污染土壤中DEHP试验结果表明：以理论浓度为100mg·kg-1污染土壤为修复目标，与未接菌污染土壤相比，接种菌株XB处理（灭菌土壤接菌、未灭菌土壤接菌）的污染土壤DEHP残留量均大幅下降，在第10d时分别削减了52.2%与59.7%，降解半衰期分别为8.78d和7.30d，显著低于未接菌处理（84.8~184d）。 （5）土壤盆栽玉米试验表明：与污染土壤空白处理相比（DEHP初始浓度为20mg·kg-1和100mg·kg-1），接种降解菌XB或种植玉米处理可以降低土壤DEHP残留量，促进土壤DEHP降解，二者的DEHP去除率于第25d（第50d）为50.50%~59.91%（71.77%~78.23%）；而玉米接种降解菌XB处理的DEHP去除率在第50d高达85.41%，说明降解菌XB能与玉米形成良好的协同作用，有效降解土壤中的DEHP。与不接菌处理相比，玉米接种菌株XB能显著提高玉米根系和茎叶的超氧化物歧化酶活性（3%～154%）、过氧化氢酶活性（11%～58%）及多酚氧化酶活性（48%～288%），显著降低丙二醛含量（11%～60%），增加玉米生物量（5%～86%），长时间培育下增加玉米根系对DEHP的吸收积累（7.5%～12.6%）、降低高浓度胁迫下茎叶DEHP含量。显示玉米与降解菌XB联合能有效修复DEHP污染土壤，保障农产品安全，具有应用前景。

目录

第一个书签之前