EV71受体的筛选、功能鉴定及纳米银运载siRNA抑制EV71的机制研究

摘要

肠道病毒71型（Enterovirus71,EV71）属小RNA病毒科肠道病毒属病毒，是婴幼儿手足口病的主要病原体。EV71病毒感染可引起严重的神经精神症状，如神经性肺水肿、脑干脑炎、无菌性脑炎、肢体麻痹等。EV71病毒具有嗜神经特性，容易引起神经细胞损伤，造成体内细胞因子风暴发生，引起交感神经系统兴奋，分泌有毒物质，进而导致肺部、心脏、脑干等组织受损。细胞受体是决定病毒感染的第一因素，目前尚未有EV71病毒特异的神经细胞受体报道。本文利用pull-down技术成功筛选了热休克蛋白70(Heat shock protein70,HSP70)、热休克蛋白78(Heat shock protein78,HSP78)、波形蛋白3个EV71病毒受体蛋白，其中HSP70蛋白、HSP78蛋白在神经细胞中的含量较多。在EV71病毒感染的治疗方面，目前尚无效果明显的特效药物，而有报道纳米银材料具有良好的抗菌抗病毒功效，因此本文利用功能化纳米银对EV71病毒诱导的宿主细胞凋亡进行了体外抑制的初步探讨。 本文利用小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA)技术及基因转染技术研究HSP70蛋白与EV71病毒间的相互作用，分析HSP70蛋白在EV71病毒感染中所起到的作用。根据HSP70基因设计合成siRNA，将HSP70基因的特异性siRNA转染入RD细胞，通过PCR和Western blot实验验证干扰效率，并在转染后接种EV71病毒，发现干扰后的RD细胞上清中EV71病毒滴度并未增高。另将HSP70基因连接到pcDNA3.1+真核表达载体，将重组表达载体转入对EV71病毒不敏感的L929小鼠细胞，构建新型转基因细胞模型。过表达HSP70蛋白的L929细胞接种EV71病毒后，未见细胞病变效应，但是通过流式细胞试验发现，EV71病毒能够吸附到过表达HSP70的L929细胞上。由此推测HSP70蛋白在EV71病毒感染进程中并非关键受体蛋白，可能起辅助性受体作用，协助吸附EV71病毒至宿主细胞上，但是无法独立协助完成EV71病毒脱壳、复制等功能。 HPS78蛋白是很多嗜神经病毒的重要受体，如日本脑炎病毒、博尔纳病毒等。HSP78蛋白能够协助病毒吸附到细胞表面，并参与病毒进入细胞后的复制装配过程。本文表达了重组HSP78蛋白，发现该重组蛋白能促进EV71病毒感染Vero细胞，同时该重组蛋白的小鼠免疫血清对EV71病毒在Vero细胞中的复制有抑制作用，但HSP78基因沉默并不能使感染EV71病毒的细胞上清中病毒毒力降低。在SK-N-SH细胞，EV71病毒能与细胞膜HSP78蛋白结合并使其表达上调。以上结果表明，HSP78蛋白能增强EV71病毒感染宿主细胞，但其作用是辅助性的，抑制其表达并不能使感染减弱。 HSP70蛋白、HSP78蛋白在很多神经细胞中均有表达，参与病毒对宿主细胞的感染。EV71病毒侵入机体，激活神经细胞中的HSP70蛋白、HSP78蛋白的表达，进而促进EV71病毒在细胞内增殖，增强病毒对神经细胞的侵袭作用。EV71病毒对神经细胞的感染效率高与神经细胞的受体蛋白有很大的关系，EV71病毒嗜神经性及重症发生率高也与神经细胞受体有很大的相关性。本文发现HSP78蛋白是抗EV71病毒的靶点，这将为将来EV71病毒重症的治疗和防治提供很好的理论依据。 临床上针对EV71感染尚无特效药，其灭活疫苗依然存在风险。纳米银具有良好抗菌抗病毒功能。本文利用纳米银运载针对EV71病毒VP1基因的siRNA转染Vero细胞，发现经纳米银预保护的Vero细胞病变效应减弱，经纳米银运载siRNA预保护组减弱尤为明显；细胞存活率实验和透射电镜观察到EV71病毒结构破坏，提示纳米银运载siRNA对EV71病毒有直接杀伤作用；磷脂酰丝氨酸、线粒体膜电位、流式细胞术、蛋白印迹等体外实验也展现了良好的抑制EV71感染细胞效果；并发现纳米银运载siRNA通过活性氧激活的信号通路抑制EV71病毒诱导宿主细胞凋亡。此部分研究可为临床预防和治疗手足口病提供新的思路和实验依据。

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