多巴酚丁胺对脓毒症心肌功能障碍大鼠心肌功能与心肌细胞凋亡的影响

摘要

目的: 脓毒症心功能障碍是脓毒症患者常见的并发症,是脓毒症患者死亡的重要原因,目前临床上尚缺乏特异性的有效治疗措施.新近的临床指南建议,对于足够液体复苏和使用血管活性药物后仍存在持续性低灌注和心输出量降低的患者,可以使用β1肾上腺素能受体(β1-adrenergic receptor,β1-AR)激动剂多巴酚丁胺(dobutamine,DOB)作为正性肌力药物进行治疗.然而,心肌功能障碍发生后给予DOB,是否确实能够改善脓毒症诱导的心肌功能障碍?尚缺乏直接的实验依据.因此,本研究使用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)复制脓毒症大鼠模型,观察脓毒症诱发心肌功能障碍后给予DOB对脓毒症大鼠心肌功能及心肌细胞凋亡的影响,为指导脓毒症心功能障碍患者的临床治疗提供实验依据. 方法: 第一部分:观察轻度CLP模型大鼠心肌功能障碍及其他器官功能障碍发生的时间. 雄性SD大鼠随机分为假手术组和盲肠结扎穿孔术(CLP)组,在距离盲肠盲端1.2cm处结扎盲肠、在结扎盲肠的中间位置用18号注射针头穿孔,复制轻度CLP模型,术后观察大鼠生存率.另分批实验,假手术或CLP术后6h、9h、12h,分离大鼠心脏,分别用Langendorff离体装置测定心肌内在收缩与舒张功能.利用7600自动生化分析仪测定大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)与门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)的活性以及尿素氮(urea nitrogen,BUN)的水平.同时取肺组织,测定肺湿干重比值(wet-dry weight ratios,W/D)的变化. 第二部分:观察重度CLP模型大鼠心肌功能障碍及其他器官功能障碍发生的时间,并测定大鼠血清炎症细胞因子、心肌损伤标志物以及心脏炎症细胞因子与细胞黏附分子的表达水平. 雄性SD大鼠随机分为假手术组和盲肠结扎穿孔术组,在距离盲肠盲端1.5cm处结扎盲肠、在结扎盲肠的中间位置用18号注射针头穿孔,复制重度CLP模型,术后观察大鼠的生存率.另分批实验,于假手术或CLP术后6h、9h、12h,分离大鼠心脏,用Langendorff离体装置检测大鼠心肌内在收缩与舒张功能;用ELISA法测定血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、N末端B型钠尿肽前体(N-terminalprobrainnatriuretic peptide,NT-proBNP)、心型脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid–binding protein,H-FABP)以及心肌肌钙蛋白I(cardiac troponinI,cTnI)水平;用实时荧光定量PCR测定心脏细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule,ICAM-1)mRNA,TNF-α?mRNA,血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule,VCAM-1)mRNA表达;用Western blot测定心脏VCAM-1蛋白的表达;同时测定大鼠血清中ALT,肌酐(creatinine,Cr)和BUN水平以及肺W/D ratios的变化. 第三部分:观察脓毒症大鼠心肌功能障碍发生后给予DOB对脓毒症大鼠生存率、心肌功能、血清与心脏组织中炎症细胞因子、心肌cTnI磷酸化以及心肌细胞凋亡的影响. 将雄性SD大鼠随机分为5组,sham组、CLP组、CLP+2.5μg/kg/min DOB组、CLP+5.0μg/kg/min DOB组和CLP+10.0μg/kg/min DOB组.于CLP或假手术后6h经颈静脉持续泵入DOB或生理盐水2h(2ml/h).观察各组大鼠术后10d的生存率.另分批实验,将雄性SD大鼠随机分为6组,sham组、CLP组、CLP+5.0μg/kg/min DOB组、CLP+10.0μg/kg/min DOB组、sham+5.0μg/kg/min DOB组和sham+10.0μg/kg/min DOB组.给药方式同上,分别于假手术或CLP术后20h,分离心脏,用Langendorff离体装置测定各组大鼠的心肌收缩与舒张功能;用ELISA法测定血清TNF-α、白介素-10(interleukin-10,IL-10)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及心肌组织TNF-α、IL-1β的水平;荧光检测试剂盒测定心脏组织中caspase-3的活化情况;Western blot分析心脏cleaved caspase-3的表达及心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)磷酸化水平;用TUNEL(terminal transferase dUTP nick end labeling)测定心肌细胞凋亡. 结果: 1.轻度CLP模型大鼠CLP术后10d的生存率为73.3%,术后9h左心室内压最大上升(the maximal rate of increase of LV pressure,LV+dP/dt)与下降速率(the maximal rate of decrease of LV pressure,LV–dP/dt)显著低于假手术组,CLP术后12h ALT明显高于假手术组(P<0.05),CLP术后9h、12h AST明显高于假手术组(P<0.05),而CLP术后6h、9h、12h,血清BUN和肺W/Dratios与假手术组相比,两者之间没有显著差异(P>0.05). 2.重度CLP模型大鼠术后10d的生存率为36.4%,重度CLP模型在CLP术后6h、9h、12h,左心室?dP/dt明显低于假手术组(P<0.05),而大鼠血清心肌损伤标志物NT-proBNP、H-FABP及cTnI,与假手术组比较,没有显著差别(P>0.05).CLP术后6h、9h、12h,血清TNF-α的水平明显高于假手术组(P<0.05),心肌ICAM-1mRNA、TNF-αmRNA、VCAM-1mRNA及VCAM-1蛋白的表达显著高于假手术组(P<0.05).CLP术后9h血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)的活性高于假手术组(P<0.05),但CLP术后6h、9h、12h,血清BUN、Cr及肺W/D ratios与假手术组相比,没有显著差别(P>0.05). 3.对于重度CLP模型,CLP术后6h(已存在心肌收缩与舒张功能障碍)给予不同剂量的DOB对脓毒症大鼠生存率的影响:Sham组术后10d大鼠的生存率为100%,CLP组术后10d大鼠的生存率为45.5%,24h-48h为死亡高峰期.CLP+2.5μg/kg/min DOB组为60%、CLP+5.0μg/kg/min DOB组为31.6%,与CLP组生存率比较,没有显著差别(P>0.05).然而,CLP+10.0μg/kg/min DOB组大鼠生存率为75%,显著高于CLP组(P<0.05).CLP术后20h,CLP组左心室?dP/dt明显低于假手术组(P<0.05);CLP术后6h给予不同剂量的DOB,CLP术后20h,CLP+5.0μg/kg/min DOB组和CLP+10.0μg/kg/min DOB组,左心室的最大上升速率与最大下降速率(?dP/dt)与CLP组相比没有显著差别(P>0.05);CLP+5.0μg/kg/min DOB组和CLP+10.0μg/kg/min DOB组脓毒症大鼠血清及心肌组织中TNF-α、IL-1β的水平与CLP组比较没有显著差别,心脏组织caspase-3的活性、cleaved caspase-3蛋白表达及cTnI磷酸化水平与CLP组比较没有显著差别;CLP术后20h,CLP+5.0μg/kg/min DOB组和CLP+10.0μg/kg/min DOB组与CLP组比较,TUNEL显示的心肌细胞凋亡没有显著差别(P>0.05).然而,CLP术后20h,CLP+10.0μg/kg/min DOB组脓毒症大鼠血清中IL-10水平明显高于CLP组(P<0.05). 结论: 1.轻度CLP模型(距盲肠末端1.2cm处结扎)大鼠,CLP术后9h出现心肌收缩与舒张功能障碍,术后12h出现肝功能损伤;重度CLP模型(距盲肠末端1.5cm处结扎)大鼠,CLP术后6h即出现心肌收缩与舒张功能障碍,术后9h出现肝功能损伤;这些结果表明心肌内在收缩与舒张功能障碍是脓毒症早期并发症,其发生在肝功能障碍,血清Cr和BUN以及肺W/D ratios出现异常之前.血清心肌损伤标志物NT-proBNP、H-FABP及cTnI的水平并不能在早期及时反映脓毒症诱导的心肌内在收缩与舒张功能障碍. 2.对于重度CLP模型大鼠,心肌收缩与舒张功能障碍发生(CLP术后6h)后给予DOB,不能改善脓毒症后期(CLP术后20h)大鼠的心肌功能,对脓毒症诱导的心肌炎症反应与心肌细胞凋亡没有明显影响.这些结果表明,临床上使用DOB治疗脓毒症诱导的心功能障碍,缺乏充分的实验依据. 3.对于重度CLP模型大鼠,心肌收缩与舒张功能障碍发生(CLP术后6h)后,给予10.0μg/kg/min DOB可改善脓毒症大鼠的生存,其机制可能与其促进抗炎细胞因子IL-10的生成有关.

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