特异性敲除内皮细胞自噬相关基因Atg7对糖尿病小鼠创面愈合的影响

摘要

血管新生是创面愈合的重要环节，也是组织修复的基础。血管内皮细胞作为血管新生的中心环节，在多种因子的刺激下发生增殖、迁移、分化，形成新生毛细血管网，从而促进伤口愈合，改善组织修复质量。自噬作为一种动态的亚细胞结构的清除方式与血管新生和组织修复密切相关。我们先前通过建立血管内皮细胞Atg7特异性敲除小鼠创面模型表明，内皮细胞自噬功能受损后创面愈合速率加快，推测机体可能通过旁分泌途径调节成纤维细胞、表皮细胞的增殖、迁移，进而促进创面愈合。已有的研究表明，自噬在糖尿病、糖尿病并发症及创面愈合过程中均发挥重要作用。本研究通过阐明自噬相关的微血管损害在糖尿病创面难愈发生中的作用，为临床创面难愈的治疗提供理论基础。 目的： 通过建立血管内皮细胞Atg7特异性敲除糖尿病小鼠模型，观察小鼠血管内皮细胞自噬相关基因Atg7对糖尿病创面愈合的影响。 方法： 1.建立两种基因型小鼠（即Floxed-Atg7F/F和Cdh5-Cre+/+），保种并扩大繁殖，使用PCR基因鉴定技术，鉴别出Atg7特异性基因敲除小鼠； 2.使用链脲佐菌素（STZ）药物诱导小鼠建立糖尿病动物模型； 3.建立小鼠背部全层皮肤缺损的创面模型，Image J分析软件计算创面愈合情况； 4.HE染色观察创面上皮移行距离； 5.Western blot技术检测蛋白表达，分析小鼠自噬水平； 6.应用SPSS13.0对数据进行统计学分析，以均数±标准差（mean±SD）表示，独立样本t检验用于两组间均数比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。 结果： 1．获得并鉴定血管内皮细胞Atg7条件性敲除小鼠 将获得的两种基因型小鼠（即Floxed-Atg7F/F、Cdh5-Cre+/+）适应性喂养一周后，相互交配并得到第一代双基因杂合子小鼠，即Atg7EC+/-，将该基因型小鼠进行自交，即可得到实验所需的基因型，即野生型（wide type，WT）,纯合子（Atg7F/F；Cdh5-Cre+，即Atg7EC-/-），及两种工具鼠（Atg7F/F、Cre+）。 2.糖尿病模型的建立 研究得出，STZ诱导后小鼠血糖持续增高，至第4周达血糖高峰，第6-8周趋于稳定水平，且Atg7EC-/-组成模率为75%，WT组成模率为72%，两者间成模率无统计学意义。对糖尿病小鼠背部皮肤创面进行形态学分析，发现在模型建立成功后第12周，光镜下普遍出现表皮细胞层次排列紊乱、细胞肿胀、间隙增大；真皮胶原变细、排列紊乱；脂肪细胞空泡化。 3.内皮细胞自噬功能缺乏对糖尿病小鼠背部皮肤创面愈合速率的影响 研究表明，与对照组WT小鼠相比，Atg7EC-/-组小鼠创面面积显著缩小，愈合率加快，且在创伤后第5天至第11天WT组小鼠创面面积均大于Atg7EC-/-组。基于糖尿病对皮肤创面愈合的影响，故以WT糖尿病组小鼠为对照组进行后续实验，与Atg7EC-/-糖尿病组小鼠的创面愈合速率进行比较。与对照组WT糖尿病小鼠相比，Atg7EC-/-糖尿病组小鼠创面面积减小，创面愈合速率加快（P＜0.05）。 对小鼠背部皮肤创面进行形态学分析皮肤创面形成第7天创面周围组织上皮爬行距离，发现Atg7EC-/-组小鼠上皮爬行距离平均为2.28mm，WT组小鼠为1.17mm，两者间差异有统计学意义；Atg7EC-/-糖尿病组小鼠上皮爬行距离平均为1.72mm，WT糖尿病组为0.98mm，且差异有统计学意义（P＜0.01）。 4.小鼠内皮细胞Atg7敲除效率的表达及自噬功能的检测 与WT，WT+DM小鼠相比，Atg7EC-/-,Atg7EC-/-+DM小鼠LC3I向LC3II的转化能力明显降低，自噬小体的成熟发生障碍，小鼠血管内皮细胞自噬受影响，P62发生堆积。通过WT与WT+DM，Atg7EC-/-与Atg7EC-/-+DM的比较，发现WT+DM和Atg7EC-/-+DM小鼠的LC3I向LC3II的转化能力明显降低，自噬小体成熟受到影响，推测糖尿病状态可使机体自噬水平受损，进而影响衰老细胞器的降解。此外，通过比较WT,Atg7EC-/-,Atg7EC-/-+DM,WT+DM组小鼠组间自噬通量水平与创面愈合率的情况，得出结论，内皮细胞Atg7特异性敲除小鼠，自噬通量降低，小鼠创面愈合率加快；而在糖尿病状态下，自噬功能异常，使得机体创面愈合率相对非糖尿病状态下减慢。 结论： 内皮细胞Atg7自噬功能缺陷促进糖尿病的创面愈合，而糖尿病导致的自噬功能异常可能是糖尿病创面愈合障碍的原因之一。

目录

声明

前言

第一部分特异性敲除内皮细胞自噬相关基因Atg7对糖尿病小鼠创面愈合的影响

一、 材料与方法

1.1 实验动物

1.2 实验试剂

1.3 主要溶液及配置

1.4 主要仪器及设备

1.5 实验地点

1.6 实验小鼠的饲养及基因型的鉴定

1.7 糖尿病模型的建立

1.8 小鼠背部皮肤创面的建立及创面愈合情况的观察

1.9 苏木素-伊红（hematoxylin and eosin HE）染色切片观察

1.10 数据分析

二、 实验结果

2.1 内皮细胞Atg7特异性敲除小鼠的繁殖及基因型鉴定

2.2糖尿病小鼠的一般体征及血糖、体重变化

2.3内皮细胞自噬功能缺乏对糖尿病小鼠背部皮肤创面愈合速率的影响

三、讨论

三、结论

第二部分特异性敲除内皮细胞自噬相关基因Atg7通过调节自噬水平影响糖尿病小鼠的创面愈合

一、材料与方法

1.1 实验试剂

1.2 主要溶液及配置

1.3 主要仪器及设备

1.4 实验地点

1.5 血管内皮细胞体外分离、培养

1.6 Western blot检测小鼠血管内皮细胞Atg7、LC3I/II、P62的表达

1.7 数据分析

二、实验结果

2.1 内皮细胞Atg7敲除效率的鉴定

2.2 小鼠内皮细胞自噬水平的表达

2.3 小鼠内皮细胞自噬水平与创面愈合率之间的关系

三、讨论

四、结论

参考文献

中英文词汇对照

综述:自噬在糖尿病血管损害发病中的作用及与创面难愈关联性的研究

攻读硕士学位期间发表的文章

攻读硕士学位期间参加的学术会议

致谢

特别致谢