一种基于自噬关键蛋白ATG7的突变体及其应用

摘要

本发明属于生物技术和延缓衰老的治疗领域，涉及一种基于自噬关键蛋白ATG7的突变体及其在延缓衰老治疗中的应用，特别涉及通过氨基酸位点突变模拟蛋白修饰状态及其在延缓衰老治疗中的应用。一种基于自噬关键蛋白ATG7的突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No1，其中第411和413为赖氨酸突变为谷氨酰胺，第513，514和516位氨基酸突变为精氨酸，所述的一种基于自噬关键蛋白ATG7的突变体在制备成靶向延缓衰老或防治衰老相关疾病药物中的应用。本发明提供的基于自噬关键蛋白ATG7的突变体经实验验证，可以从改善细胞核功能，改善细胞增殖状态，改善细胞代谢状态发挥延缓衰老的药理作用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和延缓衰老的治疗领域，涉及一种基于自噬关键蛋白ATG7的突变体及其在延缓衰老治疗中的应用，特别涉及通过氨基酸位点突变模拟蛋白修饰状态及其在延缓衰老治疗中的应用。

背景技术

衰老作为一种不可避免的自然生命过程，是自然界普遍存在的现象，并且伴随逐渐衰退的组织和器官功能。伴随人类衰老进程，老年性疾病如心血管疾病、神经退行性疾病、癌症、糖尿病等的发病风险也随之升高。因此，延缓衰老对于预防和治疗衰老相关的疾病意义重大。随着人们对衰老机制的不断探索，衰老与遗传和表观遗传改变密切相关。因此获得适合的蛋白的修饰靶点成为了延缓衰老的关键环节。随着分子生物学技术的发展，诱导大量纯化蛋白突变体的方法不断更新，为延缓衰老的治疗开辟了新的领域。

研究表明，自噬在衰老过程中起到非常重要的作用，但具体机制尚未阐明。目前延缓衰老的方法多数基于影响代谢通路的分子，而非发挥主动调节作用的功能性蛋白。因此，基于调控自噬的关键蛋白突变体对延缓衰老的治疗具有开创性意义。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一种基于调控自噬水平的关键蛋白的突变体及其在延缓衰老治疗中的应用，该蛋白特征为自噬相关蛋白的特定位点氨基酸突变体，能够模拟该蛋白修饰的状态，从而调节细胞自噬水平，延缓衰老。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种基于自噬关键蛋白ATG7的突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No1，其中第411和413为赖氨酸突变为谷氨酰胺，第513，514和516位氨基酸突变为精氨酸。

进一步地，所述的一种基于自噬关键蛋白ATG7的突变体有两个功能性突变位点，均为突变的乙酰化位点，其中K411、413为模拟该位点乙酰化形式突变，K513、514、516为模拟该位点去乙酰化形式突变。

更进一步地，所述的一种基于自噬关键蛋白ATG7的突变体两处突变的最终效应为突变体蛋白能够激活自噬，延缓衰老。

所述的一种基于自噬关键蛋白ATG7的突变体，其蛋白为通过替换五个氨基酸而衍生自所述的氨基酸序列组成的突变蛋白。

所述的一种基于自噬关键蛋白ATG7的突变体是通过人工合成纯化获得。

所述的一种基于自噬关键蛋白ATG7的突变体在制备靶向延缓衰老或防治衰老相关疾病药物中的应用。

进一步地，所述药物的剂型为任何药物治疗学上可接受的剂型。

进一步地，所述药物的剂量为任何药物治疗学上可接受的剂量。

一种靶向延缓衰老或防治衰老相关疾病药物，包括所述的基于自噬关键蛋白ATG7的突变体作为活性成分。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下。

1)本发明提供的基于蛋白突变体基于ATG7蛋白原有的蛋白的结构，但具有五个突变位点，在氨基酸序列上具有原始创新性。

2)本发明提供的基于自噬关键蛋白ATG7的突变体是通过人工合成纯化获得，制备方法简单，纯度可控。

3)本发明提供的基于自噬关键蛋白ATG7的突变体经实验验证，可以从改善细胞核功能，改善细胞增殖状态，改善细胞代谢状态发挥延缓衰老的药理作用。

附图说明

图1是基于P1、P6以及P6+突变体的细胞核形态检测。

图2是基于P1、P6以及P6+突变体的细胞增殖检测。

图3是基于P1、P6以及P6+突变体的细胞半乳糖苷酶染色。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图详细介绍本发明的技术方案和技术效果。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知，以下实施例仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1基于自噬关键蛋白ATG7的突变体的制备。

一种基于自噬关键蛋白ATG7的突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No1，其中第411和413为赖氨酸突变为谷氨酰胺，第513，514和516位氨基酸突变为精氨酸。

所述基于自噬关键蛋白ATG7的突变体的制备方法如下：采用真核表达系统，在HEK293T细胞中过表达带有flag标签的ATG7的突变体的质粒，表达48小时后收集细胞，提取蛋白，在蛋白提取液中加入flag-beads，4℃混转过夜，4℃收集flag-beads，利用flag-peptide竞争洗脱ATG7蛋白突变体，洗脱液即为纯化的ATG7蛋白突变体。

实施例2基于自噬关键蛋白ATG7的突变体药理学研究。

一、衰老细胞模型的建立、实验分组。

首先进行原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养。取13.5天小鼠胚胎，分离躯干至于1×PBS；弃PBS，加入0.125％胰蛋白酶，于37℃培养箱消化15～20min。种植培养液(DMEM+15％血清)终止消化，室温离心，沉淀重悬后种植于6cm2细胞培养皿。基因型鉴定后，取ATG7-/-的MEF分别感染慢病毒阴性对照和flag-ATG7突变体。

二、细胞核形态检测。

对稳定过表达阴性对照和flag-ATG7突变体的MEF细胞进行体外传代培养，多聚赖氨酸于12孔板内室温包被细胞爬片2小时。将体外传代的第1代MEF种植于12孔板爬片，37℃，5％CO2孵箱内培养24小时。弃培养基，1×PBS洗3次，4％多聚甲醛室温固定20分钟。1×PBS洗3次，10mg/ml Hoechst33342储存液1：100稀释于超纯水中，室温染色30分钟。1×PBS洗3次，用含防荧光淬灭剂的封片剂将细胞爬片固定于载玻片上。荧光显微镜观察细胞核，第6代MEF操作同前所述，结果如图1所示。

三、细胞增殖检测。

对稳定过表达阴性对照和flag-ATG7突变体的MEF细胞进行体外传代培养，多聚赖氨酸于12孔板内室温包被细胞爬片2小时。将体外传代的第1代MEF种植于12孔板爬片，37℃，5％CO2孵箱内培养24小时。弃培养基，1×PBS洗3次，4％多聚甲醛室温固定20分钟。1×PBS洗3次，0.25％Triton X-100室温通透15分钟。1×PBS洗3次，5％BSA室温封闭1小时。Ki67抗体1：400稀释于1×PBS中，4℃染色过夜。1×PBS洗3次，荧光二抗1：1000稀释于1×PBS中，室温染色1小时，1×PBS洗3次，DAPI 1：1000稀释于1×PBS中，室温染色3分钟，1×PBS洗3次，用含防荧光淬灭剂的封片剂将细胞爬片固定于载玻片上。荧光显微镜观察细胞核，第6代MEF操作同前所述，结果如图2所示。

四、半乳糖苷酶染色。

对稳定过表达阴性对照和flag-ATG7突变体的MEF细胞进行体外传代培养，多聚赖氨酸于12孔板内室温包被细胞爬片2小时。将体外传代的第1代MEF种植于12孔板爬片，37℃，5％CO2孵箱内培养24小时。弃培养基，1×PBS洗3次，4％多聚甲醛室温固定20分钟。1×PBS洗3次，半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色液于pH6.0，37℃，无CO2环境中染色过夜。荧光镜下观察细胞染色状况，第6代MEF操作同前所述，结果如图3所示。

实验证明，本发明提供的基于自噬关键蛋白ATG7的突变体，可以从改善细胞核功能，改善细胞增殖状态，改善细胞代谢状态发挥延缓衰老的药理作用。

序列表

<110> 中国医科大学

<120> 一种基于自噬关键蛋白ATG7的突变体及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1 .0

<210> 1

<211> 676

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Ala Ala Thr Gly Asp Pro Gly Leu Ser Lys Leu Gln Phe Ala Pro Phe Ser Ser

1 5 10 15 20

Ala Leu Asp Val Gly Phe Trp His Glu Leu Thr Gln Lys Lys Leu Asn Glu Tyr Arg Leu

25 30 35 40

Asp Glu Ala Pro Lys Asp Ile Lys Gly Tyr Tyr Tyr Asn Gly Asp Ser Ala Gly Leu Pro

45 50 55 60

Ala Arg Leu Thr Leu Glu Phe Ser Ala Phe Asp Met Ser Ala Pro Thr Pro Ala Arg Cys

65 70 75 80

Cys Pro Ala Ile Gly Thr Leu Tyr Asn Thr Asn Thr Leu Glu Ser Phe Lys Thr Ala Asp

85 90 95 100

Lys Lys Leu Leu Leu Glu Gln Ala Ala Asn Glu Ile Trp Glu Ser Ile Lys Ser Gly Thr

105 110 115 120

Ala Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asn Lys Phe Leu Leu Leu Thr Phe Ala Asp Leu Lys

125 130 135 140

Lys Tyr His Phe Tyr Tyr Trp Phe Cys Tyr Pro Ala Leu Cys Leu Pro Glu Ser Leu Pro

145 150 155 160

Leu Ile Gln Gly Pro Val Gly Leu Asp Gln Arg Phe Ser Leu Lys Gln Ile Glu Ala Leu

165 170 175 180

Glu Cys Ala Tyr Asp Asn Leu Cys Gln Thr Glu Gly Val Thr Ala Leu Pro Tyr Phe Leu

185 190 195 200

Ile Lys Tyr Asp Glu Asn Met Val Leu Val Ser Leu Leu Lys His Tyr Ser Asp Phe Phe

205 210 215 220

Gln Gly Gln Arg Thr Lys Ile Thr Ile Gly Val Tyr Asp Pro Cys Asn Leu Ala Gln Tyr

225 230 235 240

Pro Gly Trp Pro Leu Arg Asn Phe Leu Val Leu Ala Ala His Arg Trp Ser Ser Ser Phe

245 250 255 260

Gln Ser Val Glu Val Val Cys Phe Arg Asp Arg Thr Met Gln Gly Ala Arg Asp Val Ala

265 270 275 280

His Ser Ile Ile Phe Glu Val Lys Leu Pro Glu Met Ala Phe Ser Pro Asp Cys Pro Lys

285 290 295 300

Ala Val Gly Trp Glu Lys Asn Gln Lys Gly Gly Met Gly Pro Arg Met Val Asn Leu Ser

305 310 315 320

Glu Cys Met Asp Pro Lys Arg Leu Ala Glu Ser Ser Val Asp Leu Asn Leu Lys Leu Met

325 330 335 340

Cys Trp Arg Leu Val Pro Thr Leu Asp Leu Asp Lys Val Val Ser Val Lys Cys Leu Leu

345 350 355 360

Leu Gly Ala Gly Thr Leu Gly Cys Asn Val Ala Arg Thr Leu Met Gly Trp Gly Val Arg

365 370 375 380

His Ile Thr Phe Val Asp Asn Ala Lys Ile Ser Tyr Ser Asn Pro Val Arg Gln Pro Leu

385 390 395 400

Tyr Glu Phe Glu Asp Cys Leu Gly Gly Gly Gln Pro Gln Ala Leu Ala Ala Ala Asp Arg

405 410 415 420

Leu Gln Lys Ile Phe Pro Gly Val Asn Ala Arg Gly Phe Asn Met Ser Ile Pro Met Pro

425 430 435 440

Gly His Pro Val Asn Phe Ser Ser Val Thr Leu Glu Gln Ala Arg Arg Asp Val Glu Gln

445 450 455 460

Leu Glu Gln Leu Ile Glu Ser His Asp Val Val Phe Leu Leu Met Asp Thr Arg Glu Ser

465 470 475 480

Arg Trp Leu Pro Ala Val Ile Ala Ala Ser Lys Arg Lys Leu Val Ile Asn Ala Ala Leu

485 490 495 500

Gly Phe Asp Thr Phe Val Val Met Arg His Gly Leu Arg Arg Pro Arg Gln Gln Gly Ala

505 510 515 520

Gly Asp Leu Cys Pro Asn His Pro Val Ala Ser Ala Asp Leu Leu Gly Ser Ser Leu Phe

525 530 535 540

Ala Asn Ile Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Cys Tyr Phe Cys Asn Asp Val Val Ala Pro Gly

545 550 555 560

Asp Ser Thr Arg Asp Arg Thr Leu Asp Gln Gln Cys Thr Val Ser Arg Pro Gly Leu Ala

565 570 575 580

Val Ile Ala Gly Ala Leu Ala Val Glu Leu Met Val Ser Val Leu Gln His Pro Glu Gly

585 590 595 600

Gly Tyr Ala Ile Ala Ser Ser Ser Asp Asp Arg Met Asn Glu Pro Pro Thr Ser Leu Gly

605 610 615 620

Leu Val Pro His Gln Val Leu Asp Gln Tyr Glu Arg Glu Gly Phe Asn Phe Leu Ala Lys

625 630 635 640

Val Phe Asn Ser Ser His Ser Phe Leu Glu Asp Leu Thr Gly Leu Thr Leu Leu His Gln

645 650 655 660

Glu Thr Gln Ala Ala Glu Ile Trp Asp Met Ser Asp Asp Glu Thr Ile

665 670 675