广藿香倍半萜生物合成关键酶广藿香醇合成酶基因的克隆与功能分析

摘要

植物累积产生的次生倍半萜类代谢产物是天然产物中化学结构繁多且大都具有生物活性的一类化合物，在植物的生长、发育过程中发挥重要的作用。鉴于倍半萜类化合物具有重要的经济价值和生态意义，随着倍半萜类代谢途径及其调控机理的深入研究，以基因工程技术为手段的代谢工程有望成为提高植物体内倍半萜类化合物含量的有效方法之一。 广藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.为我国传统中药之一，隶属于唇形科Lamiaceae刺蕊草属Pogostemon，以干燥地上部分入药。现代药理学研究表明广藿香累积产生的广藿香油具有抗氧化、镇痛、抗炎、抗菌、抗真菌、抗血栓、抗抑郁等众多的生物活性。广藿香油像其他精油一样具有成分复杂的特点，但同时也具有独特的一面，即所含组分多为倍半萜类成分。广藿香醇合成酶（Patchoulol synthase，PTS）是广藿香油形成过程中的一个限速酶，可催化倍半萜前体法尼基焦磷酸（Farnesyl diphosphate，FDP）转化形成包括广藿香醇在内的多达14种不同的倍半萜化合物，尤其以广藿香醇的含量最高。本研究采用RACE、原核表达载体构建和qPCR等技术，以广藿香为材料，克隆得到PTS基因的全长cDNA序列，并对其基因序列和基因功能进行了鉴定和分析。主要结果如下： 1.首次克隆得到了PTS基因的全长cDNA序列，该cDNA序列全长为1939bp，其中包括1659bp完整的开放阅读框（Open reading frame，ORF），共编码552个氨基酸；同时含有61bp的5′非翻译区（5′UTR）和219bp的3′非翻译区（3′UTR），GenBank登录号为MG386648。 2.将PTS基因插入原核表达载体pET32a中构建重组质粒，在大肠杆菌中诱导表达，表达产物经Western免疫印迹（Western blot）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）鉴定，确认为广藿香醇合成酶，命名为Pc-PTS1。该原核表达载体序列开放阅读框全长为1713bp，编码570个氨基酸，分子量为65.77kD，等电点为5.44。生物信息学分析表明，Pc-PTS1与其他萜类合成酶的同源性介于45%–63%之间，且含有植物萜类合成酶特有的6个高度保守序列和被子植物倍半萜合成酶特有的6个保守序列。跨膜区分析表明，Pc-PTS1不属于信号肽，说明其可能定位于细胞质。二级结构预测α-螺旋和无规则卷曲是Pc-PTS1蛋白中主要的结构元件。三维结构模型分析表明，Pc-PTS1与来自本木棉的(+)-δ-杜松烯合成酶同工酶XC1结构最相似。 3.PTS在不同栽培型广藿香中的时空表达强度均存在明显的差异。在海南-1和海南-2广藿香中，PTS在叶、茎中的表达均为11月份最高；在石牌-1和石牌-2广藿香中，PTS在叶中的表达均为8月份最高，而在茎中的最高表达有异：在石牌-1广藿香中，PTS在11月份表达最高，在石牌-2广藿香中，PTS在9月份表达最高；在印尼-1和印尼-2广藿香中，PTS在叶的表达均为11月份最高，在茎中的最高表达有异：在印尼-1广藿香中，PTS在10月份表达最高，在印尼-2广藿香中，PTS在11月份表达最高；在高要广藿香中，PTS在叶、茎中的表达均为11月份最高。 4.不同栽培型广藿香PTS的表达水平与广藿香油活性成分积累的相关性分析表明，PTS的表达量与叶、茎中相应的广藿香醇和广藿香酮的含量均不存在相关性。 5.在1天24小时的昼夜周期中，PTS呈现明显的昼夜节律变化，表达峰分别出现在1:00h，5:00h，7:00h，9:00h，16:00h，19:00h和22:00h这7个时间点，且其在夜间有更高的震荡频率和转录丰度。 综上，通过对广藿香倍半萜生物合成关键基因PTS的克隆与功能分析，为进一步探索广藿香倍半萜的生物合成机理，以及利用生物技术大规模生产具有重要价值的倍半萜化合物提供潜在的指导，这不仅有益于广藿香药物资源保护，而且为其资源的充分开发利用提供依据。

目录

声明

缩略词表

第一章 前言

1.1 倍半萜化合物的生物合成途径

1.2 倍半萜化合物生物合成途径中的相关酶

1.3 不同栽培型广藿香的研究概况

1.4 广藿香醇合成酶的研究概况

1.5 植物代谢生物钟的研究概况

1.6 本论文研究内容

1.7 本论文研究目的及意义

第二章 广藿香patchoulol合成酶基因的克隆和表达

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三章 广藿香patchoulol合成酶基因的时空表达及与倍半萜类成分累积的相关性研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

第四章 广藿香patchoulol合成酶基因的生理钟研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

第五章 总结与展望

参考文献

附录1 广藿香叶和茎挥发油的GC-MS图

论文发表情况

致谢