CHO细胞分泌外泌体中包裹重组外源蛋白的分析与研究

摘要

外泌体是由各种类型细胞分泌的盘状囊泡，直径通常为30～200nm，可携带脂类、蛋白质、信使RNAs（mRNAs）、microRNAs（miRNAs）、非编码RNAs（ncRNAs）等多种重要的供体细胞来源的生物功能分子，并且这些分子可以通过应激或病理条件的改变而改变。这种囊泡状小体作为载体具有独特的优势，如其免疫原性低，在血液中的稳定性高，向细胞运输药物的效率高和更强的增强渗透滞留效应（EPR）等，故目前外泌体作为药物的天然内源性载体的研究受到关注，外泌体可以运送核苷酸、蛋白质和化学药物可能会成为治疗人类疾病的一种很有前途的方法，但是现在外泌体RNA等小分子的研究较多，而携带大分子蛋白质药物的研究还很缺乏。 本研究中，我们在CHO细胞稳定表达外源重组蛋白的基础上，对CHO细胞分泌的外泌体中的重组目的蛋白的包载进行了分析，探索以CHO细胞这一成熟的工业用细胞作为外泌体大规模生产细胞的可行性。 首先，我们培养了稳定表达Her2抗体的CHO细胞，在培养过程中，细胞的最高密度达到2.08×107cells/mL，在day18时，Her2抗体蛋白表达量达到2.9g/L；收取细胞培养液经ProteinA柱子纯化后收取穿透液，通过超高速离心的方法获取外泌体，使用透射电镜和纳米粒径分析仪发现，提取到的外泌体呈现双层膜的“杯状”结构，直径约为100nm左右，属于外泌体的粒径范围。同时经Western blot检测CD63、TSG101等外泌体标记蛋白的表达，进一步证实提取的囊泡为外泌体；同时，Western blot检测结果表明外泌体中含有目的蛋白Her2抗体；通过蛋白质谱鉴定了外泌体中的蛋白数，发现Her2抗体含量在外泌体总蛋白中处于很高水平，以富集的形式存在于外泌体中。进一步将抽提的外泌体处理过表达Her2的BT474细胞，结果显示外泌体对BT474细胞的增殖有明显的生长抑制作用，说明表达Her2抗体的CHO细胞的外泌体中含有目的蛋白且蛋白是具有生物活性的。 为了进一步验证实验结果不是特异性的，我们选取了另一株稳定高表达分泌性重组TNFR-Fc的CHO细胞，细胞培养后纯化培养上清收取穿透液提取外泌体，对外泌体进行电镜、粒径、形貌分析以及Western blot和蛋白质谱鉴定，证明获得了含有TNFR-Fc的外泌体。外泌体作用于L929细胞，检测结果表明：TNFR-Fc融合蛋白能中和TNF-α对细胞的杀伤作用，因此上述结果依然成立。 为了探讨影响重组蛋白进入外泌体的因素，构建了三种连有不同分泌效率信号肽的EGFP重组质粒，转染CHO细胞进行瞬时表达，收取细胞上清提取外泌体，通过比较外泌体中EGFP与外泌体标记蛋白的比例，发现重组蛋白的分泌效率越高，被装载进外泌体的概率越大。同时，从表达量不同的细胞培养上清中提取外泌体，通过对外泌体中重组外源蛋白与外泌体标记蛋白的比值分析，发现细胞中外源蛋白的产量越高，被包装进外泌体的几率越大。 CHO细胞是目前生产重组蛋白的最主要的表达系统，表达技术和培养技术十分成熟，蛋白表达量可以达到3-5g/L，可以无血清悬浮培养，规模放大简便。无血清培养更避免了外泌体提取中血清的干扰，本研究证明了CHO细胞可以生产包裹有活性重组蛋白的可能性，为使用CHO细胞作为大规模生产载药外泌体的平台提供了依据。

目录

声明

缩略词表

第一章 绪论

1CHO细胞

2外泌体

3外泌体——天然载药系统

4本论文的研究目的和意义

5技术路线

1实验材料

2实验方法

3实验结果与分析

4讨论

第三章 影响外泌体装载外源蛋白的探讨

1实验材料

2实验方法

3实验结果与分析

4讨论

第四章 结论与展望

1结论

2展望

参考文献

硕士期间发表论文

致谢