定向分化人间充质干细胞自组装肝芽样组织

摘要

目的：肝脏疾病是造成世界人口疾病死亡的主要原因之一。当前，针对终末期肝病的临床治疗手段主要有细胞移植和肝移植，干细胞移植现在处于非常初期的阶段，有待进一步研究。同种异体肝移植是最直接有效的治疗手段，但供体肝源缺乏、手术费用昂贵、操作要求高、术后免疫排斥反应等原因限制了其在临床中的应用。所以，寻找可供移植的肝组织刻不容缓。人间充质干细胞具有取材简单、不具有伦理争议、具有多向分化潜能、适宜自体移植、体外增殖迅速、免疫原性低等优点，可作为理想的细胞移植细胞，甚至作为肝脏组织工程的种子细胞。迄今，多数研究主要通过诱导多能干细胞体外构建3D肝芽，而利用间充质干细胞体外组装肝芽的相关文献甚少，未见将同一来源的人间充质干细胞分化至肝细胞、肝星状细胞和肝内皮细胞并混合组装的报道。为此，致力于将间充质干细胞定向诱导分化成三种肝脏细胞，以一定的比例混合体外组装成为3D人源肝芽，并初步探究其应用于急性肝损伤治疗的可能性。 方法：培养经鉴定纯化的人间充质干细胞，通过在培养基中添加Wnt3a、FGF4和BMP4等分化因子，将人的间充质干细胞定向诱导分化为肝样细胞、肝内皮样细胞和肝星状样细胞，使用流式细胞术分离各细胞系，进一步以免疫荧光染色、RT-PCR技术进行检测鉴定；并在基质胶上以10：3：3：1的比例混合自发组装，通过微阵列分析的方法比较自组装的3D肝芽与早期小鼠肝脏组织的基因表达谱；然后，建立更昔洛韦特异性诱导小鼠急性肝损伤模型，将组装的肝芽移植到肝损伤的小鼠肠系膜中，观察小鼠存活时间，苏木精-伊红染色检测肝损伤组织的病理学改变。同时，通过微阵列分析肝芽组织及其移植后38个成熟肝脏标志基因的表达谱，RT-qPCR检测AFP、ALB、CYP3A4、CYP2C9、CYP2D6、G6PC、GLUT2、HNF4α和UGT2B7基因的水平，ELISA检测小鼠血清中ALB、AAT的分泌情况，原位免疫荧光染色观察肝脏功能性蛋白ALB和CK8/18的变化。 结果：形态学、基因表达谱以及流式细胞术分选结果表明，人脐带血干细胞诱导分化为肝样细胞、肝星状样细胞和肝内皮样细胞，其分化效率分别为74%、21%和19%；各细胞系列在体外按比例混合培养72h后能够自组装成为3D肝芽样组织，其基因表达谱与胚胎期第10d小鼠肝脏的相似；急性肝损伤的小鼠接受3D肝芽移植手术治疗后18d，其存活率（90%）明显高于假性手术组（50%），肝组织损伤程度明显改善；移植肝芽的小鼠血清中AAT、ALB含量分别上升至400ng/mL和800ng/mL，原位移植肝芽样组织中明显表达ALB和CK8/18，移植肝芽中ALB、CYP3A4、CYP2C9、CYP2D6、G6PC、GLUT2、HNF4α和UGT2B7等成熟肝脏表达的基因水平明显升高，呈现与成人肝脏相似的基因表达特征。 结论：人脐带血干细胞成功定向诱导分化为肝样细胞、肝星状样细胞和肝内皮样细胞，分化得到的肝脏细胞能够按比例混合培养自组装成为肝芽样组织，体内肝芽移植能明显改善急性肝损伤的程度，降低急性肝损伤小鼠的死亡率。该研究提供了一种利用间充质干细胞分化成为肝脏细胞，并在体外自组装功能性肝芽的新方法，为药物筛选模型的建立奠定了基础。

目录

声明

前言

1肝损伤与治疗现状

2肝脏组织工程的研究进展

3组织工程的细胞来源

4肝脏细胞的研究进展

5研究思路和目的

材料与方法

1细胞和动物来源

2主要试剂

3试剂配制

4主要仪器

5人间充质干细胞向肝细胞的诱导分化

6人间充质干细胞向肝星状细胞和肝内皮细胞的诱导分化

7肝芽的组装

8肝芽的移植与检测

结果

1人间充质干细胞向肝细胞分化

2人间充质干细胞向肝星状样细胞和肝内皮样细胞分化

3人肝芽的组装

4肝芽的移植

讨论

1肝细胞的诱导

2肝星状细胞的诱导

3肝内皮细胞的诱导

4肝芽组织的组装与功能

5细胞或组织移植免疫原性的探讨

小结与展望

参考文献

附录

在校期间发表的论文

致谢

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