基于细胞色素P450酶RoCYP-34445的发现在酵母中构建桦木酸的生物合成通路

摘要

桦木酸被证明是多种中药发挥抗肿瘤作用的重要成分，这些中药包括夏枯草、白头翁、夹竹桃、迷迭香等。现代药理学研究显示桦木酸以及以其为起始物的半合成衍生物不仅在抗肿瘤而且在抗HIV等方面具有光明的成药前景。目前桦木酸的工业生产依靠植物提取，或者植物提取结合化学半合成的方法，因此费时费力并且环境不友好。合成生物学的出现为桦木酸的生产提供了一种新的潜在途径。作者首先对已经公布的迷迭香转录组进行了深入挖掘，从中找到3个可能负责氧化羽扇豆醇生成桦木酸的细胞色素P450酶基因并对其进行系统进化树分析，发现这些候选CYP基因均属于CYP85簇。通过在酵母中表达和功能表征，发现RoCYP-34445在酵母中选择性地高效氧化羽扇豆醇为桦木酸。对RoCYP-34445基因进行组织表达分析，证实该CYP基因确实是迷迭香体内参与桦木酸生物合成的细胞色素P450基因。将酿酒酵母BY4741作为底盘细胞，把拟南芥中的羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs和RoCYP-34445基因导入酵母中，在酵母体内构建桦木酸的生物合成通路。该项目研究为未来用工程酵母发酵的方法规模化生产桦木酸奠定重要基础，同时也为充分利用已有的“海量”测序数据提供了一种研究思路。

目录

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缩略词表(Abbreviation)

第一章 绪论

1.1 桦木酸及其衍生物的药理活性

1.2 桦木酸的制备方式

1.3 合成生物学研究概况

1.4 桦木酸合成生物学研究概况

1.6本研究课题的目的及技术路线

第二章 材料与方法

2.1 植物材料

2.2 菌株与质粒

2.3试剂与仪器

2.4 主要溶液和培养基的配制

2.5培养方法

2.6 主要实验方法

第三章 实验结果与讨论

3.1 候选CYP和CPR基因的挖掘

3.2 非完整基因的5'/3'-RACE扩增

3.3 候选CYP基因的进化树分析

3.4 候选CYP与CPR基因的克隆与表达载体的构建

3.5 候选CYP基因体内功能表征

3.6 迷迭香中CYP基因的组织表达分析

3.7 在酿酒酵母中构建桦木酸生物合成通路

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2本研究创新点

4.3 展望

参考文献

附录

致谢