人巨细胞病毒pUL147A多克隆抗体的制备、纯化与鉴定

摘要

目的： 人巨细胞病毒（HCMV）是一种全球性易感病毒，属于β疱疹病毒科。人体免疫功能受损后，病毒感染状态由潜伏感染转变为激活感染，从而使感染人群出现多种并发症，严重时会导致机体功能失调乃至死亡。HCMV的致病机制尚不清楚，但HCMV UL/b’区基因多态性的广泛研究揭示，此基因结构区域是HCMV致病性的遗传基础。UL/b’区包括UL133-UL151这19个基因，根据UL/b’区在HCMV感染机制中的重要作用，可以推断该基因结构区域中的UL147A基因在病毒的复制、潜伏及对机体的致病性方面可能起着重要作用，而且还可能影响宿主的多种免疫调节机制。然而目前鲜少有关于UL147A基因功能的研究报道，因此本研究制备的人巨细胞病毒pUL147A多克隆抗体将有助于进一步发现UL147A基因的结构和功能，为HCMV感染机制的深入研究奠定基础。 方法： 本研究包括两部分内容： ①UL147A重组蛋白的表达与纯化：先以HCMV Towne EL-350为模板，扩增UL147A基因，然后构建pET32a(+)-UL147A重组质粒，再转化大肠杆菌DH5α，进行pET32a(+)-UL147A重组质粒的克隆，经过一系列实验鉴定后，再转化大肠杆菌BL21（DE3），进行UL147A重组蛋白的表达。优化诱导表达条件后，收集大量UL147A重组蛋白，进行Ni-NTA亲和纯化，优化纯化条件以获得高纯度UL147A重组蛋白。 ②pUL147A多克隆抗体制备：将纯化后的UL147A重组蛋白与佐剂混合形成抗原，免疫新西兰白兔，ELISA法测效价，效价达到105后，取兔抗血清，并用硫酸铵沉淀法和亲和层析法纯化得到pUL147A多克隆抗体，最后进行Western blot以验证该抗体特异性。 结果： ①UL147A重组蛋白的表达与纯化：成功构建了pET32a(+)-UL147A重组质粒，并使UL147A重组蛋白得以在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。该重组蛋白以包涵体形式表达，优化诱导表达条件后，发现其最佳IPTG诱导浓度为1.0mM、最佳诱导时间为10h、最佳诱导温度为25℃。收集大量该重组蛋白并进行Ni-NTA亲和纯化，优化纯化条件后，发现在用含不同浓度咪唑缓冲液洗脱蛋白样品时，含150mM咪唑缓冲液洗脱效果最好，能得到较高纯度的UL147A重组蛋白。 ②pUL147A多克隆抗体制备：兔抗血清纯化后，经ELISA检测，效价≥105，经Western blot验证分析得到，pUL147A多克隆抗体特异性良好。 结论： ①成功构建了UL147A重组蛋白原核表达体系，并获得高纯度的UL147A重组蛋白。 ②成功制备了纯度较高、特异性良好的pUL147A多克隆抗体。

目录

声明

第一章 前言

1.1人巨细胞病毒简介

1.2 人巨细胞病毒与宿主细胞的相互作用简介

1.3 人巨细胞病毒疫苗发展史简介

1.4 本课题研究意义

第二章 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第三章 实验结果

3.1 UL147A分子克隆

3.2 UL147A重组蛋白诱导表达

3.3 UL147A重组蛋白纯化

3.4 pUL147A多克隆抗体制备与纯化

3.5 pUL147A多克隆抗体效价测定

3.6 pUL147A多克隆抗体特异性验证

第四章 分析与讨论

第五章 总结与展望

一．结论

二．展望

参考文献

附录

缩略词中英文对照

研究生期间发表的论文

致谢