夏橙果实发育过程中的类胡萝卜素积累及乙烯的调控研究

摘要

夏橙（Citrus sinensis Osbeck）果实后期的生长发育及成熟进程中，果皮颜色发生着由绿色转为黄色，到了次年2月份果皮颜色部分又从黄色返回一定绿色的现象，即返青现象，影响了果实的商品价值。本文对这一现象进行了生理学和分子生物学方面的研究与探索。首先将夏橙果实后期的发育和成熟过程分为转黄期（P1-P4）及返青期（P5-P7）共7个发育时期，观察分析了果实从P1发育至P7过程中果实品质、果皮外观颜色、色素含量的变化；其次在克隆类胡萝卜素合成途径中关键酶基因PSY、PDS和ZDS的3’cDNA末端全长的基础上，检测不同时期胡萝卜素合成关键酶基因PSY、PDS和ZDS的表达变化，并研究了乙烯对返青前后夏橙果实品质、果皮颜色、类胡萝卜素积累及PSY、PDS和ZDS基因表达的影响；最后探索了夏橙的返青过程与环境温度的变化关系。主要结果如下：
　　 1、采用RT-PCR和3’RACE技术获得了夏橙果皮类胡萝卜素合成的三个关键酶PSY、PDS和ZDS基因的3’全长，拼接后长度分别为790bp、1418bp和1774bp，同源性分析表明，它们氨基酸的序列与同其它果蔬物种相应基因的同源性达90％以上。
　　 2、将夏橙果实的后期生长发育和成熟过程分为7个时期（P1-P7），从P1-P7果皮颜色发生由青至黄，继而返青的变化，P1-P4期为转黄期，P5-P7为返青期。从P1至P3期叶绿素含量快速下降，之后维持在一个相对稳定的水平，类胡萝卜素的总量在P1期最低，之后呈显著上升趋势，到P4期果皮呈明亮黄色时含量最高，之后随着返青现象的出现，类胡萝卜素总量又下降，夏橙果皮中叶绿素和类胡萝卜总量的变化与果皮由绿转黄，然后又部分返青的颜色变化一致。PSY、PDS和ZDS基因在P4及P5期表达较强，这与P4和P5期类胡萝卜素含量较高相一致，且与这两个时期果皮的色差值外观相符：随着P6及P7期果实外观的返青，类胡萝卜素含量下降，PSY、PDS和ZDS基因表达也随之减弱。
　　 3、返青前P2和P3期果实在贮藏过程中，PSY和PDS基因的表达逐渐增强，而不同发育阶段的果实在贮藏过程中ZDS基因表达变化不同。乙烯处理可显著促进返青前P2期果皮着色、类胡萝卜素积累和PSY基因的表达，对PDS基因表达的促进作用较弱，对ZDS基因表达的影响不明显。而乙烯处理在P3期早期显著增强PDS和ZDS基因的表达，但对PSY基因表达的促进较弱。
　　 4、在返青的P6期施加乙烯，不影响果实中叶绿素和类胡萝卜素的积累，但对P6期PSY和PDS基因的表达减弱有抑制作用，乙烯处理后6d和12d，PSY和PDS基因表达明显比未处理对照上调。
　　 5、对于代表果实品质的可溶性固形物、可滴定酸和VC含量测定的结果表明，从P1到P7期，可溶性固形物逐渐增加，可滴定酸含量逐渐下降，P6和P7期VC含量高。乙烯处理P2和P3期果实后，可溶性固形物、可滴定酸和VC含量变化不大，说明乙烯处理只影响果皮的色泽而对果实的品质影响不大。
　　 6、结合田间温度及实验室温度处理实验表明，2月份的气温回升与果实的返青时间一致，P4期夏橙果实在30℃恒温条件下贮藏一段时间后，夏橙果皮色差a*值和b*值降低，呈现一定的同田间相似的返青现象，因此可以初步认为温度与夏橙的返青有密切的关系，值得进一步深入探讨。
　　 以上研究结果为生产上经过技术处理提高夏橙的商品价值奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

主要符号对照表

第一章 前言

1．1 夏橙及返青现象

1．2 高等植物体内类胡萝l、素的研究进展

1．2．1 类胡萝卜素的功能

1．2．2 类胡萝卜素的生物合成

1．2．3 类胡萝卜素合成中关键酶基因表达的调控

1．3 乙烯与色素及果皮颜色变化的关系

1．4 研究的目的及意义

第二章 材料与方法

2．1 供试材料

2．2 果实处理及取样方法

2．3 生理指标的测定方法

2．3．1 叶绿素及类胡萝卜素含量的测定

2．3．2 颜色评定方法

2．3．3 果实品质的分析方法

2．4 类胡萝卜素关键酶基因PSY、PDS和ZDS的cDNA分离

2．4．1 果皮总RNA的提取

2．4．2 总RNA浓度的测定及完整性检测

2．4．3 cDNA第一链的合成

2．4．4 PSY、PDS和ZDS基因cDNA片段的扩增和检测

2．4．5 目的基因片段回收

2．4．6 与载体连接

2．4．7 转化

2．4．8 阳性克隆的鉴定

2．4．9 阳性克隆的测序

2．5 PSY、PDS和ZDS的cDNA3’末端克隆

2．6 基因表达检测方法

2．6．1 RNA印迹(转膜)

2．6．2 探针制备

2．6．3 Northern杂交方法

2．7 所用试剂来源及仪器设备

第三章 结果与分析

3．1 夏橙果皮总RNA的提取

3．2 PSY、PDS和ZDS基因的cDNA克隆

3．3 PSY、PDS和ZDS基因3’末端cDNA的克隆

3．4 地高辛标记的探针制作

3．5 RNA印迹(转膜)

3．6 夏橙发育过程中果皮颜色、叶绿素和类胡萝卜素积累、PSY、PDS和ZDS基因表达及果实品质的变化

3．6．1 发育进程中果实外观及品质变化

3．6．2 发育进程中果皮色差的变化

3．6．3 发育进程中果皮色素含量的变化

3．6．4 发育进程中PSY、PDS和ZDS基因表达的变化

3．7 乙烯对返青前P2期夏橙果实品质、果皮叶绿素、类胡萝卜素积累变化及PSY、PDS和ZDS基因表达的影响

3．7．1 乙烯处理对P2期夏橙果皮色差的影响

3．7．2 乙烯处理对P2期夏橙果皮色素含量的影响

3．7．3 乙烯处理对P2期夏橙果实品质的影响

3．7．4 乙烯处理对P2期夏橙果皮中PSY、PDS和ZDS基因表达的影响

3．8 乙烯对返青前P3期夏橙果实品质、果皮叶绿素、类胡萝卜素积累变化及PSY、PDS和ZDS基因表达的影响

3．8．1 乙烯处理对P3期夏橙果皮色差的影响

3．8．2 乙烯处理对P3期夏橙果皮色素含量的影响

3．8．3 乙烯处理对P3期夏橙果实品质的影响

3．8．4 乙烯处理对P3期夏橙果皮中PSY、PDS和ZDS基因表达的影响

3．9 乙烯对返青后P6期夏橙果实果皮叶绿素、类胡萝卜素积累变化及PSY、PDS和ZDS基因表达的影响

3．10 夏橙返青现象与环境温度变化的关系

3．10．1 夏橙后期发育成熟及返青过程中气温变化对夏橙返青的影响

3．10．2 贮藏温度对P4期果实果皮颜色的影响

第四章 讨论

4．1 果实发育过程中果皮颜色、色素含量变化与PSY、PDS和ZDS基因表达的关系

4．2 乙烯对不同发育时期果实PSY、PDS和ZDS基因表达的调控

4．3 温度与返青的关系

结论

参考文献

致 谢