副猪嗜血杆菌分离鉴定及血清学分型方法的建立

摘要

副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis，H.parasuis/HPS）是一种不运动的具有多种形态，严格依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（也称之为V因子）的革兰氏阴性小杆菌，是巴斯德氏菌科（Pasteurellaceae)嗜血杆菌属（Haemophilus）的成员，也是猪革拉泽氏病(Gl(a)sser'sdisease)的病原菌，猪纤维浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎是该病主要特征，主要引起保育仔猪和幼年猪群发病和死亡。随着我国养猪业的发展和集约化水平的提高，副猪嗜血杆菌感染越来越多，该病已流行于世界多数国家和地区，表现出猪只突然死亡，发病率和死亡率均较高，给养殖企业造成巨大经济损失，严重危害养殖业的发展，是全球养猪业的一个巨大的难题。目前在国内尚未有用于分型的商品化标准血清，因此，开展分型血清的制备和分型方法的建立对快速确定分离株的血清型和进行相关治疗就显得尤为重要。
　　首先，本实验从华北地区疑似副猪嗜血杆菌感染的猪场采集了多种病料，通过使用TSA培养基，成功分离到19株细菌;进一步纯化后进行了细菌形态学观察、培养特性和生化鉴定，种特异性PCR也扩增出1090bp的目的片段，证明19株分离株均为副猪嗜血杆菌。
　　进一步对分离株的药物敏感性、致病性和毒力基因进行了研究，发现19株分离株具有除GS-3外都具有强致病性和多重耐药性，但是对大环内酯类类抗生素仍很敏感，这对华北地区猪场该病的防制提供了用药指导;对潜在毒力基因的扩增结果也与小鼠感染实验结果相符，证明nhaC、hhdA和hhdB基因可能与H.parasuis的毒力有关，而fhuA并非毒力基因。
　　其次，实验中我们通过将副猪嗜血杆菌15个参考菌株在TSA固体培养基上进行培养，扩大培养后用PBS将菌体从培养基上洗下来，灭活后用于免疫白兔，抗体产生后采血制备了15个血清型的抗血清。用琼脂扩散试验检验了抗血清的交叉反应性，玻片凝集法测定了抗血清的效价。根据交叉反应的结果，采取交叉吸附的方法制得了15个血清型的单因子血清。
　　用单因子血清对分离得到的19株H.parasuis分离株进行血清型的分型，结果表明，19株分离株均能被准确分型。又用单因子血清琼扩试验和间接血凝试验对本实验室早期分离的四株副猪嗜血杆菌进行了分型，间接血凝试验分型结果均有交叉反应，无法定型;而单因子血清可以对四株分离株准确分型。表明所建立的单因子血清琼扩分型法具有良好的特异性，分型率较间接血凝试验高。

目录

声明

摘要

缩略词表

第1章 文献综述

1．1 副猪嗜血杆菌介绍

1．2 副猪嗜血杆菌分型方法研究进展

1．3 H.parasuis致病机理研究进展

1．4 H.parasuis毒力因子的鉴定研究进展

1．5 诊断方法研究进展

1．6 防制及疫苗使用现状

1．7 选题目的及意义

第2章 副猪嗜血杆菌的分离鉴定及相关特性研究

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第3章 副猪嗜血杆菌血清学分型方法的建立及初步应用

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

结论

致谢

参考文献

作者简介

攻读硕士学位期间发表的论文