中国安徽间日疟原虫DBPII克隆表达及其鉴定

摘要

目的：（1）克隆中国安徽流行区间日疟原虫达菲血型结合蛋白 II区基因（Plasmodium vivax Duffy Binding Protein region II，PvDBPII）；（2）体外原核表达和鉴定重组PvDBPII蛋白。
　　方法：（1）根据GenBank收录的间日疟原虫Sa1-1株PvDBPII基因（GI：156081788）序列设计引物，从镜检阳性的间日疟原虫感染血样本中抽提 DNA为模板，应用PCR技术从间日疟基因组DNA中扩增DBPII基因。PvDBPII PCR产物与pET-28a载体分别经Nco I和Hind III双酶切后连接克隆入原核表达载体pET28a(+)中，构建pET28a(+)-PvDBPII重组表达质粒，采用双酶切及测序方法鉴定重组质粒。（2）将重组质粒pET28a(+)-PvDBPII转化至大肠埃希菌BL21(DE3+)中，IPTG诱导表达带有His标签的重组蛋白，采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白，采用 SDS-PAGE电泳和Western Blotting分析鉴定表达产物。
　　结果：（1）PCR体外扩增得到目的基因片段长约1.1 kb。双酶切及测序结果显示目的基因己被正确地连接入重组质粒 pET28a(+)中，其插入片段序列与Sa1-1株PvDBPII基因参考序列相比存在四个非同义突变位点（R319G、D384G、R390H和L424I）。（2）重组质粒转入大肠埃希菌后，诱导表达的重组蛋白分子量约为44 kDa，且能被间日疟患者血浆特异性识别。在37℃，IPTG0.5 mmol/L诱导表达4h可达到最大表达量，表达产物为不可溶包涵体。
　　结论：成功克隆了中国安徽流行区间日疟原虫 PvDBPII基因，表达出了重组PvDBPII蛋白，并优化了 PvDBPII重组蛋白的原核表达条件，验证了其抗原性，为进一步研究基于PvDBPII的红内期间日疟疫苗提供了基础。

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中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1. PvDBPII基因的扩增

2. PvDBPII /pET-28a重组表达载体的构建及鉴定

3. PvDBPII /PET-28a的测序结果

4.重组质粒pET28a（+）-PvDBPII的诱导表达

5. 表达条件的优化结果

6. Western Blotting分析

讨论

结论

参考文献

致谢

附录A

附录B常用试剂配制

附录C个人简历

综述： 疟疾疫苗的研究进展