蓖麻氨基酸转运蛋白ATF和APC家族参与的GlyF在植物体内的输导性研究

摘要

“导向农药”是将植物内源糖或氨基酸及其衍生物与农药母体连接，让不具有韧皮部输导性的农药母体获得韧皮部输导性，从而提高农药输导靶向性的理念。为了完善氨基酸导向农药理论，对耦合了氨基酸基团的甘氨酸氟虫腈(GlyF)在蓖麻幼嫩子叶的吸收输导机理进行了植物生理学和分子生物学水平的系统研究。
　　用荧光指示剂染料 DiBAC4(3)和流式细胞仪检测手段检测 GlyF对蓖麻原生质体的膜电位影响，结果显示GlyF对蓖麻原生质体短时间内无毒性，可用于后续实验。
　　用幼嫩蓖麻子叶进行GlyF韧皮部输导性检测。5小时内，蓖麻子叶韧皮部液中的GlyF随着时间含量逐渐升高，说明甘氨酸的引入改善了氟虫腈母体的韧皮部输导性。
　　Kleier模型是预测化合物韧皮部输导性的经典模型。模型预测GlyF落在韧皮部输导性区域外，这与韧皮部输导性检测结果不相符，说明 GlyF的蓖麻子叶吸收存在除被动扩散外的吸收机制。
　　蓖麻子叶叶碟吸收实验发现，谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、能量抑制剂CCCP和膜蛋白抑制剂pCMBS对GlyF的吸收都有显著抑制。GlyF的吸收是浓度依赖的，100μmol/L浓度时随时间改变能达到最大吸收。同时该吸收过程对pH和温度敏感。
　　通过生物信息学方法鉴定并命名了蓖麻的62个氨基酸转运蛋白，它们分为两大家族ATF(氨基酸转运蛋白家族)和APC(氨基酸聚胺转运蛋白家族)。ATF至少可以分成5个亚家族，RcAAP、RcLHT、RcAUX、RcANT和RcProT，分别有10、9、4、15和7个成员；APC家族有RcCAT和RcBAT两个家族，分别含有15和2个成员。62个基因在蓖麻子叶中均有表达，其中表达量较高的基因有17个，综合半定量和荧光定量实验，最终获得了四个高表达差异基因RcLHT6、RcANT15、RcProT2和RcCAT2。
　　用100μmol/LGlyF浓度处理蓖麻子叶1小时、3小时和6小时，RT-qPCR结果显示：四个基因1小时基因表达量对比CK上调明显，都超过1倍，RcCAT2上调了3.5倍；3小时和6小时除RcLHT6的表达提高外，其他三个基因表达量出现下调(3小时RcANT15表达差异不明显)。
　　构建了四个差异基因蛋白绿色荧光蛋白表达载体，表达于 BY2烟草细胞原生质体实现亚细胞定位。亚细胞定位显示四个基因表达产物在烟草细胞膜和细胞质上均有定位。综合以上实验结果，这四个蛋白很可能参与了 GlyF在幼嫩蓖麻子叶的吸收转运。

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目录

1前言

1.1导向农药概况

1.2 氨基酸转运蛋白概述

1.3 植物氨基酸转运蛋白

1.4 导向农药的发展和机遇

1.5 实时荧光定量

1.6 研究的目的以及意义

1.7 研究内容

1.8 本研究的实验设计与技术路线

2实验材料

2.1 供试植物

2.2 供试药物

2.3 质粒与菌株

2.4 主要试剂

2.5 主要培养基

2.6 主要试剂的配置

2.7 生物信息学分析软件及相关网站

2.8 主要仪器

3 实验方法

3.1 细胞膜电位测试

3.2 GlyF蓖麻体系输导性检测

3.3 GlyF的理化性质预测

3.4 GlyF蓖麻子叶叶碟吸收实验

3.5 液相检测条件

3.6 蓖麻氨基酸转运蛋白ATF和APC家族的鉴定和分离

3.7 GlyF处理蓖麻糖转运蛋白表达半定量分析

3.8 GlyF理下蓖麻氨基酸转运蛋白表达定量分析

3.9 差异基因亚细胞定位

4 实验结果

4.1 GlyF对蓖麻原生质体膜电位的影响

4.2 Gly在蓖麻幼苗上的韧皮部输导性

4.3 GlyF的理化性质预测

4.4 GlyF蓖麻叶碟实验

4.5 蓖麻ATF和APC氨基酸转运蛋白家族的鉴定和进化分析

4.6 GlyF处理后蓖麻氨基酸转运蛋白基因半定量表达分析

4.7 RT-qPCR目标基因丰度筛选

4.8 GlyF处理下的ATF和APC家族转运蛋白RT-qPCR相对定量表达分析

4.9 四个差异基因亚细胞定位

5 结论与讨论

5.1 结论

5.2 讨论

5.3 有待进一步解决的问题

5.4 本论文的创新之处

致谢

参考文献

附录A 硕士期间相关成果

附录B：