猪流行性腹泻病毒YX株的分离鉴定及其灭活疫苗免疫效力试验研究

摘要

猪流行性腹泻（PED）是由冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种以仔猪水样腹泻、呕吐、脱水为主要特征的接触性肠道传染病。猪流行性腹泻是世界上流行最广泛的猪病之一。近年，猪流行性腹泻作为烈性传染病，开始疯狂肆虐我国广大养殖户。我国的广东、广西、江西、湖南、福建、浙江、安徽、江苏、湖北、河北和山东等省（自治区）均有猪流行性腹泻的发现。PED在我国的流行面逐渐扩大，对26个省市自治区的调查表明PED的总死亡率占36种疾病总死亡率的1.74％。该病多发于冬春季节，但就广东地区这个全年高湿度的环境，PED呈高发趋势，全年均可发生，7天龄内的新生仔猪在发生腹泻后3?4天，通常因脱水导致衰竭而死亡，病死率高达100%。目前，在广东粤西地区，猪流行性腹泻呈高发趋势，一旦进入冬春季节，该病都是大规模爆发，病死率高。虽然可以采取疫苗接种方式来控制此病流行，但经典的CV777株疫苗免疫后效果并不理想，接种过疫苗的猪场仍然有此病的流行。本研究主要分为下面三个部分：
　　1、PEDV-YX株的分离鉴定。本研究从广东粤西9个疑似发生腹泻疫情的规模化猪场采集180份病料样本。通过在Vero细胞培养基中添加胰酶的方法孵育、选取1%接毒量接种 Vero单层细胞，进行病毒分离纯化，从中分离出9株未知病毒HS1、HS2、HS3、HS4、YC1、YC2、YC3、YC4和KP，经胶体金快速诊断技术、RT-PCR扩增、基因序列比对，确诊均为猪流行性腹泻病毒（PEDV）。通过猪体回归试验，选取临床症状最明显，毒力最强的YC1毒株作为研究对象，命名为PEDV-YX株。在胰酶总浓度为7.5ug/ml的作用下，盲传到第8代，能观察到细胞圆缩、聚集，空泡增多等明显的细胞病变。
　　2、对PEDV-YX株生物学特性、中和试验及其TCID50测定研究。对PEDV-YX株生物学特性、中和试验及其TCID50研究表明，该分离株对5-BrdU不敏感，为具有囊膜的RNA病毒；对乙醚、氯仿敏感；在pH为3.0的环境下易失活；对热敏感，在50℃条件下作用1h，病毒易失活；设计特异性引物，进行RT-PCR扩增，电泳检测得到与预期长度一致的条带；与PEDV抗血清中和效价为120.23；PEDV-YX F10的TCID50为10-5.67/0.1ml。
　　3、PEDV-YX株氢氧化铝胶灭活疫苗制备及不同免疫剂量、不同免疫途径对抗体水平的影响研究。PEDV-YX株F10经0.3%的甲醛溶液灭活，以病毒液样40ml+PBS40ml+20ml铝胶佐剂的培苗方案，配制猪流行性腹泻灭活疫苗。以口服免疫、后海穴注射免疫为免疫途径，2ml、1ml、0.5ml不同免疫剂量，研究该灭活疫苗的抗体消长规律。当免疫剂量相同时，后海穴注射免疫比口服免疫抗体效价更高，且抗体维持时间更长；当免疫途径相同时，免疫2ml的抗体整体水平比免疫1ml的更高，免疫0.5ml的中和抗体水平最低。
　　通过分离广东粤西地区PEDV的流行性毒株，为了解该地区流行性毒株的特性及流行情况，建立PEDV快速准确的诊断方法及新型疫苗的研究提供理论依据，从而为制定有效的防控措施，促进该地区养猪业的稳定发展做好铺垫。

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1 前言

1.1 猪流行性腹泻的发病机理及病原学特性

1.2 猪流行性腹泻的临床症状及病理变化

1.3 猪流行性腹泻的诊断

1.4 猪流行性腹泻的发病原因分析及其防制措施

1.5 研究目的与意义

2 材料和方法

2.1 材料

2.2 方法

3.1胶体金试剂盒检测结果

3.2 RT-PCR结果

3.3 测序及序列比对结果

3.4 猪体回归试验结果

3.5 病毒分离后纯化

3.6 病毒生物学特性研究结果

3.7 PEDV-YX株F10病毒中和试验结果

3.8 PEDV-YX株F10的TCID50测定

3.9 PEDV-YX株氢氧化铝胶灭活疫苗不同免疫剂量、不同免疫途径对抗体水平的影响研究

4 讨论

4.1 猪流行性腹泻病毒YX株的分离鉴定分析

4.2 PEDV-YX株的生物学特性研究、微量中和试验和毒力测定分析

4.3 PEDV-YX株氢氧化铝胶灭活疫苗制备及其免疫效力分析

5 结论

致谢

参考文献