响应低磷的大豆蛋白磷酸酶GmHAD1亚家族生化和功能分析

摘要

磷是植物生长发育所必需的大量元素之一，在植物的整个生命活动中发挥着重要作用。由于自身的理化特性，土壤中的磷容易被固定而难以被作物直接吸收利用，导致我国大部分土壤，特别是南方酸性红壤，有效磷含量较低，已经成为限制我国作物产量的主要因素之一。以往的研究表明，提高根系酸性磷酸酶活性是作物适应低磷环境的重要机制之一。本研究以蛋白磷酸酶High halogen acid dehydrogenase1(HAD1)家族为研究对象，在大豆中克隆了GmHAD1亚家族的四个成员，并对GmHAD1亚家族成员进行了表达模式分析、亚细胞定位分析和蛋白生化特性分析。在此基础上，进一步选取在大豆叶和根受低磷处理显著增强表达的GmHAD1-2为候选基因，研究其控制大豆根系生长和磷吸收效率的生物学功能。主要研究结果如下：
　　1）序列比对分析表明，大豆 GmHAD1亚家族具有四个成员，即 GmHAD1-2、GmHAD1-4、GmHAD1-6和GmHAD1-7。通过氨基酸序列比对发现HAD1亚家族成员都具有HAD家族特有的三个保守结构域，即位于N端的DxDx(T/V)（保守域I）和含有一个保守的丝氨酸残基（保守域II）、位于C端的K-(x)18-22(GDxxxD)（保守域III）。
　　2）定量RT-PCR分析表明大豆GmHAD1亚家族成员的表达模式受到磷有效性的调控。低磷处理显著增加 GmHAD1亚家族成员在两种大豆基因型的叶部和根部的表达，尤其是GmHAD1-2、GmHAD1-4和 GmHAD1-7。它们在大豆叶部和根部的表达量均比正常磷处理条件下增加了10倍以上。而且，在低磷处理条件下，GmHAD1-7在磷高效的大豆基因型，BX10的叶部和根部的表达量比在磷低效大豆基因型，BD2的表达量高。
　　3）通过烟草表皮细胞的瞬间表达系统，研究了GmHAD1亚家族成员的亚细胞定位。结果显示，GmHAD1-2、GmHAD1-4、GmHAD1-6和GmHAD1-7主要定位于细胞膜和细胞核。通过大肠杆菌异源表达系统，获得了 GmHAD1-2、GmHAD1-4、GmHAD1-6和GmHAD1-7融合GST的纯化蛋白。底物特异性分析结果表明，GmHAD1亚家族成员对酸性磷酸酶底物（对硝基苯磷酸二钠盐）和磷酸化的氨基酸（磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸、磷酸化酪氨酸）都具有水解酶活性，说明它们兼有酸性磷酸酶和蛋白磷酸酶的水解酶活性。其中，GmHAD1-2、GmHAD1-4和GmHAD1-7对磷酸化的丝氨酸具有较高的水解酶活性，GmHAD1-6对磷酸化的酪氨酸具有较高的水解酶活性。进一步对GmHAD1-2关键氨基酸定点突变的实验结果表明，第9和11位的天冬氨酸、第257位的丝氨酸对维持GmHAD1-2的水解酶活性具有显著的影响。
　　4）进一步构建了GmHAD1-2启动子驱动GUS表达载体，获得了稳定遗传的拟南芥转基因植株。GUS的活性染色结果表明，与正常磷水平处理相比，缺磷处理显著增强了GmHAD1-2在老叶及根部维管组织中的表达。
　　5）通过大豆复合植株转化法，研究了超量或抑制GmHAD1-2表达对大豆毛根生长和磷吸收的影响。结果表明，超量表达GmHAD1-2显著促进大豆毛根的生长，也显著增加了大豆植株的生物量及全磷含量。而且，抑制GmHAD1-2的表达，大豆毛根的生长受到抑制，也显著减少了大豆植株的生物量和全磷含量。以上结果初步表明了GmHAD1-2兼有酸性磷酸酶和蛋白磷酸酶的生化功能，可能直接参与调控了低磷调控大豆根系生长的的生物学功能。

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1 前言

1.1植物磷营养研究概述

1.2 酸性磷酸酶的研究进展

1.3 植物蛋白磷酸酶家族的研究进展

1.4 侧根发育研究概述

1.5 本研究的目的

1.6 研究的技术路线

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 磷有效性影响大豆的生长及磷水平

3.2 GmHAD1亚家族成员的生物信息学分析

3.3 大豆GmHAD1亚家族基因的表达模式分析

3.4大豆GmHAD1亚家族成员的亚细胞定位分析

3.5 大豆GmHAD1亚家族成员的生化分析

3.6 GmHAD1-2蛋白点突变分析

3.7大豆GmHAD1-2组织化学定位分析

3.8 GmHAD1-2的功能分析

4.1讨论

4.2结论

致谢

参 考 文 献

附录