茄科青枯菌致病力丧失相关基因的功能研究

摘要

茄科青枯菌(Ralstonia solanacearum)是世界上最重要的植物病原细菌之一，寄主范围广泛，可侵染50科450余种寄主植物。该病原菌在保存过程中易发生自然突变丧失致病力，但其机理还不清楚。本论文以分离自沙姜的茄科青枯菌自然致病力丧失突变体YC40-M作为研究对象，测定了突变体基因组全序列、筛选出突变基因、分析了5个致病相关候选基因功能，旨在揭示茄科青枯菌自然致病力丧失的分子机理，为青枯病防控技术研究提供理论依据。主要研究结果如下：
　　1．以茄科青枯菌GMI1000基因组作为参考，对沙姜青枯菌株YC40的自然致病力丧失突变菌株YC40-M及其野生型 YC40-W进行基因组重测序分析，SNP位点统计结果显示，YC40-M有45745个SNP位点，其中同义突变19443个，非同义突变18006个；YC40-W有45745位点，其中同义突变19689个，非同义突变18039个。InDel位点统计结果表明，YC40-M有1312个InDel位点，其中移码突变基因323个，非移码突变基因210个；而YC40-W有1291个InDel位点，其中移码突变基因314个，非移码突变基因208个。YC40-M与YC40-W差异位点1518个，非同义突变基因102个，包括碱基置换突变基因67个，移码突变基因35个。
　　2．应用二代高通量Illumina Miseq和第三代PacBio测序技术，对YC40-M基因组全序列进行测定，其基因组全长为5.75Mb，包含5399个基因，4个rRNA操纵子，57个tRNA，其中染色体大小为3,844,764 bp(GenBank no.CP015850)，编码3716个基因；宏质粒大小为1,907,366 bp(GenBank no.CP015851)，编码1683个基因。染色体的基因中有3081个可以归属于COG家族，宏质粒基因中有770个可以归属于COG家族，还有224个基因在数据库中没有任何匹配。
　　3．基因敲除构建YC40-W PhcA基因突变体YC40ΔPhcA。生物学测定显示，YC40ΔPhcA表型发生转换，生物膜增多，运动性增强，生长速率降低，生长增殖稳定期延长，对沙姜、番茄和辣椒的致病力较野生型菌株明显下降，验证了PhcA基因是参与青枯菌表型转换的关键基因。自然突变株YC40-M与YC40ΔPhcA相比，无致病力、无运动性、不引起烟草HR反应及在Boucher培养基中基本不生长。因此，PhcA参与青枯菌致病，而YC40-M与YC40ΔPhcA存在差异，说明青枯菌的自然致病力丧失除PhcA基因外还有其他基因参与。
　　4． ParA2基因是细胞过程一种编码基因，ParA2基因敲除与功能分析表明，YC40-W ParA2基因突变体菌落明显变小，生长缓慢，胞外多糖分泌显著减少，无流动性，生物膜形成量减少，在NA培养基和Boucher基础培养基中生长速率均降低；突变体对沙姜的致病力明显降低。因此，ParA2基因对青枯菌的生长、胞外多糖分泌及其致病有重要作用。
　　5．将YC40-W的RSp801、RSp931和RSc2202基因分别替换为YC40-M相应的突变基因片段，分别构建3个基因的突变体，其中RSp801基因突变体胞外多糖分泌增加，流动性增大，菌落直径变大，生物膜减少，在Boucher基础培养基中生长速率降低；RSp931基因突变体表型无明显变化，生物膜产量减少，在 Boucher基础培养基中生长速率降低；RSc2202基因突变体胞外多糖分泌减少，流动性减弱，菌落直径变小，生物膜产量显著降低，在Boucher基础培养基中生长速率降低。接种寄主沙姜结果表明，RSc2202基因突变体接种处理的病株率比YC40-W低50％，说明其致病力下降；RSp801和RSp931基因突变体接种处理的病株率与YC40-W相同，但前者病情发展加快，后者病情减缓，说明前者致病力较野生型增强，而后者致病力下降。因此，RSp801、RSp931和RSc2202基因与青枯菌的致病力相关。

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1 前言

1.1茄科青枯菌分布及其危害

1.2 茄科青枯菌特性

1.3青枯菌致病相关因子

1.4青枯菌群体感应下的表型转化

1.5青枯菌基因组学

1.6 沙姜青枯病菌

1.7 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2主要仪器

2.3青枯菌菌株YC40-W、YC40-M重测序分析

2.4青枯菌YC40-M基因组测序

2.5自杀质粒构建

2.6 青枯菌YC40感受态细胞的制备及电击转化

2.7 突变体筛选及鉴定

2.8基因功能互补菌株的筛选和鉴定

2.9基因的功能分析

3 结果与分析

3.1 青枯菌YC40-W、YC40-M重测序结果

3.2青枯菌YC40-M基因组测序结果

3.3 PhcA基因功能分析

3.4 ParA2基因功能分析

3.5基因RSp801、RSp931和RSc2202的功能分析

4 结论与讨论

4.1 重测序分析青枯菌YC40自然致病力丧失突变体及其野生型全基因组

4.2青枯菌YC40自然致病力丧失突变体基因组序列特征

4.3青枯菌PhcA基因的功能

4.4 YC40菌株自然致病力丧失突变体与PhcA基因缺失突变体的差异

4.5 YC40菌株ParA2基因的功能

4.6 YC40菌株RSp801、RSp931和RSc2202基因的功能

4.7 5个基因的互补试验

5总结论与未来研究建议

5.1总结论

5.2未来研究建议

致谢

参考文献