青枯劳尔氏菌EP-1胞外多糖合成缺陷突变体筛选及生物学特征研究

摘要

青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)，又称青枯菌，起初命名为青枯假单胞杆菌（Pseudomonas solanacearum），革兰氏阴性菌，是一种土传植物细菌性青枯病的病原菌。青枯菌环境适应性强、寄主范围广，可危害40多个科的数百种植物，严重影响作物产量，对农业生产危害巨大。
　　本实验利用广东地区常见的强毒力青枯菌菌株EP-1构建Tn5插入突变体库，在24,500个克隆中筛选得到15个胞外多糖明显减少的突变体，利用hiTAIL-PCR方法获得突变基因的全序列，通过酶活生物测定、生物膜检测、运动性检测和接种试验分析突变体的表型与致病性，进一步利用qRT-PCR技术分析相关基因表达量的差异，为进一步研究青枯菌胞外多糖致病性及调控机理和构建快速鉴定青枯菌致病力强弱的方法奠定基础。结果如下：
　　1.筛选得到的15个胞外多糖明显减少的突变体，分别命名为Em2、Em3、Em4、Em28、Em29、Em31、Em32、Em36、Em37、Em51、Em56、Em58、Em60、Em61和Em64。另外，获得青枯菌菌株EP-1、GMI1000、从番茄和花生分离得到的TM-1和PN-1菌株分别传代培养至60代、25代和30代得到EP-60、GMI1000-25、TM-30和PN-30。
　　2.通过hiTAIL-PCR方法确定突变体插入基因位点。比对分析表明，突变体Em2、Em3、Em4、Em29、Em31和 Em37突变在相同基因 phcA的不同位点，该基因全长1044bp，编码347个氨基酸，是青枯菌致病性调控网络的核心调控因子；突变体Em28突变在基因epsB中，该基因全长2256bp，编码751个氨基酸，位于调控网络下游，与其胞外多糖的分泌密切相关；突变体Em32突变在基因CMR15-30160中，该基因全长690bp，编码229个氨基酸，具体功能未知；突变体Em36突变在基因gstO中，该基因全长690bp，编码229个氨基酸，与谷胱甘肽转移酶的合成有关；突变体 Em51突变在基因pstS2中，该基因全长1062bp，编码353个氨基酸，可能与磷酸盐结合的周质前体ABC转运蛋白的的合成有关；突变体Em56突变在基因asd中，该基因全长1104bp，编码367个氨基酸，可能与天冬氨酸半醛脱氢酶氧化还原有关；突变体Em58突变在基因RSc1351中，该基因全长1245bp，编码414个氨基酸，可能是组氨酸激酶跨膜转录调控蛋白感受器；突变体Em60突变在基因RSc1584中，该基因全长441bp，编码146个氨基酸，推测为假定转录调控因子；突变体Em61突变在基因RSc1620中，该基因全长243bp，编码80个氨基酸，是假定跨膜蛋白；突变体 Em64突变在基因pckG中，该基因全长1869bp，编码622个氨基酸，可能是磷酸羧化酶蛋白。
　　3.通过qRT-PCR检验分析表明，突变基因导致EP-1胞外多糖相关基因和编码群体感应信号基因phcB的表达量降低；接种寄主植物表明致病性减弱，还对运动性及生物膜的形成产生影响。
　　4.初步建立了鉴定青枯菌致病力分化的检测方法。基于对得到的胞外多糖合成缺陷突变体的分析结果，或许可以选取基因phcA、gstO、RSc1351和RSc1584为靶标，通过分析基因表达量的变化，从而评估青枯菌菌株致病力强弱。

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目录

1前言

1.1青枯菌病害的概况

1.2 青枯菌病害的研究进展

1.3青枯菌中的群体感应（QS）系统

1.4青枯菌基因组与致病性的关系

1.5青枯菌致病性强弱菌株鉴定方法研究进展

1.6本研究的内容、目的和意义

2 材料与方法

2.1实验材料及仪器设备

2.2EP-1 Tn5插入突变体库的构建

2.3 突变体转座子插入检验

2.4 确定Tn5转座子插入位置

2.6 表型分析及生长曲线的测定

2.7 致病性分析

2.8基因表达和调控分析

3 结果与分析

3.1EP-1 Tn5插入突变体库的构建

3.2突变体插入检测

3.3 hiTAIL-PCR扩增获得目的基因序列

3.4表型分析及生长曲线的测定

3.5 致病性分析

3.6基因表达和调控分析

4 结论与讨论

4.1 结论

4.2 讨论

致谢

参考文献

附录