华南部分地区PRRSV流行病学调查及Nsp1α和Nsp1β的原核表达

摘要

为了了解华南地区PRRSV的遗传变异情况及抗体水平，本实验对2014-2015年间收集的华南部分地区的猪血清和病料分别进行PRRSV抗体和抗原的检测，检测结果表明：2014共采集5046份猪血清，其中PRRSV抗体阳性血清为4195份，阳性率为83.13％（4195/5046）；95%置信区间为82.67%-83.59%；2015年共采集5531份血清，经检测PRRSV阳性血清共3992份，阳性率为72.18%（3992/5531），95%置信区间为70.38%-72.4%；2014年共采集病料583份，其中 PRRSV检测为阳性的样本为192份，阳性率为33.01%（192/583），95%置信区间为32.78%-33.23%；2015年共采集病料964份，PRRSV检测阳性的样本数为356，阳性率为36.88%（356/964），95%置信区间为36.56%-37.2%，与2014年比较，2015年检测的PRRSV抗体阳性率有所下降而抗原的阳性率有所上升。
　　研究又对PRRSV阳性样本进行Nsp2和GP5基因的扩增，成功地获得31条Nsp2序列和64个GP5序列，分析比对Nsp2和GP5基因的氨基酸序列后发现：其中26株PRRSV的Nsp2基因依然是29+1个氨基酸缺失，但也存在着其他形式的氨基酸位点的缺失。与参考毒株相比，GP5基因存在着广泛的氨基酸位点的突变，主要的突变区域为信号肽区、第一高变区以及第二高变区。GP5的遗传进化树结果表明：华南地区同时存在着欧洲型和北美型PRRSV，北美型PRRSV进一步分为6个亚群，华南地区主要流行的亚群是以JXA1为代表的Subgenotype I亚群和以GM2为代表的Subgenotype VI亚群，近几年新出现的NADC30-like亚群毒株在华南地区也有出现。
　　分离、鉴定了10株PRRSV，10株PRRSV相互之间的核苷酸同源性为92.6%-97.5%，与JXA1、VR2332及CH-1R毒株的核苷酸同源性分别为95.3%-98.9%、87.8%-89.15%、91.5%-94.9%。基于全基因组的遗传进化树结果显示10株PRRSV除FJXM毒株属于过渡亚群Intermediate subgroup外，其余均属于以JXA1为代表的JXA1-like亚群，彼此之间的亲缘关系较为密切。与参考毒株相比，部分毒株的GP3、GP5、GP6蛋白的抗原位点发生了氨基酸位点的突变。
　　研究还对PRRSV的Nsp1α及Nsp1β基因进行扩增，将其连接到pET-28a表达载体后转化BL21感受态，经Western blot验证Nsp1α及Nsp1β蛋白得到了成功表达。为后续研究Nsp1α及Nsp1β蛋白的功能奠定了基础。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

英文缩写对照表

目录

1 前言

1.1 PRRSV病原学

1.2 PRRSV的流行病学特征

1.3 PRRSV的遗传变异

1.4 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 病毒、菌株、载体及细胞

2.2 细胞培养相关试剂

2.3 工具酶、试剂盒及主要的分子生物学试剂

2.4 检测样品

2.5 仪器设备

2.6 PRRSV 血清抗体的检测

2.7 引物的设计与合成

2.8 样品的RT-PCR检测

2.9 病毒的分离与鉴定

2.10 PRRSV Nsp1α及Nsp1β的原核表达

3 结果

3.1 2014-2015年华南部分地区PRRSV抗体检测结果

3.2 2014-2015年华南部分地区PRRSV抗原检测结果

3.3 2014-2015年部分Nsp2基因氨基酸比对分析

3.4 2014-2015年GP5基因遗传进化分析

3.5 2014-2015年GP5基因氨基酸同源性分析

3.6 2014-2015年GP5基因氨基酸突变位点分析

3.7欧洲型PRRSV GP5遗传进化及突变分析

3.8 病毒的分离鉴定

3.9 PRRSV全基因组的扩增

3.10 PRRSV全基因组的遗传进化分析

3.11 分离毒株全基因组的同源性分析

3.12 分离毒株Nsp2及GP3/GP5/GP6基因氨基酸突变位点分析

3.13 分离毒株Nsp9/Nsp10基因氨基酸突变位点分析

3.14 Nsp1α及Nsp1β的扩增

3.15 重组质粒的酶切鉴定

3.16 重组质粒的表达与可溶性分析

3.17 重组蛋白的最佳诱导时间的确定

3.18 重组蛋白的最佳IPTG诱导浓度的确定

3.19 重组蛋白的Western-blot鉴定

4讨论

4.1 2014-2015年华南部分地区PRRSV抗体和抗原的检测

4.2 Nsp2和GP5基因遗传进化与变异分析

4.3 PRRSV的分离鉴定及全基因组序列分析

4.4PRRSV Nsp1α和Nsp1β的原核表达

5 全文总结

致谢

参考文献