狂犬病病毒中和抗体ELISA检测方法的优化

摘要

在中国，由狂犬病病毒引起人间狂犬病的死亡人数一直位居37种法定公开传染病前列。其中，大多数案例与犬只咬伤相关。因此，确保犬只对狂犬病病毒的防御能力是切断其向人间传播的重要手段。目前，公认的量化犬只狂犬病病毒抵抗能力的方法是测定犬血液中中和抗体的水平。但中和试验对实验条件要求高且需要使用狂犬病病毒强毒株，而目前市面上的商品化试剂盒检出的为狂犬病全病毒抗体。因而检测狂犬病病毒的中和抗体难以普及。
　　本研究的目的是完善一套准确而又便捷的狂犬病病毒中和抗体ELISA试剂盒。首先，确定表达狂犬病病毒糖蛋白优势抗原RV G3的工程菌能高效表达。用IPTG诱导4h后，收集菌体。重悬并在低温环境下超声破碎菌体，收集包涵体沉淀。然后，通过8 mol/L尿素的溶解液溶解包涵体。过纯化柱获得高度纯化的RV G3蛋白，以该蛋白为抗原包被反应板，建立狂犬病病毒中和抗体间接ELISA方法。
　　经反复试验，确定RV G3蛋白的最佳包被浓度是163μg/mL；最佳包被条件为37℃1.5 h；最适的封闭剂是无蛋白封闭液；最佳封闭时间为1 h；血清最佳稀释度是1:10；最佳血清孵育时间是1.5 h；最佳血清稀释液为0.5％的脱脂乳；酶标二抗最适浓度为1:1000；最佳酶标二抗孵育时间为1 h；底物液反应时间为15 min；读数波长为450 nm。
　　此外，重复性实验表明批内和批间重复性的变异系数均小于10%。敏感性实验表明敏感度为1:160。利用此方法检测22份犬血清样品，计算的中和抗体滴度结果分别与商品化ELISA试剂盒和FAVN方法的结果比较，均说明检测的结果有相同的趋势，以及良好的相关性。
　　本研究通过优化原有的方法，建立了定量检测狂犬病病毒中和抗体的间接ELISA方法，为加快普及狂犬病病毒中和抗体提供了新途径。

目录

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目录

1前言

1.1狂犬病病原学

1.1.1分类

1.1.2 狂犬病病毒的基因结构特征

1.1.3 狂犬病病毒蛋白功能

1.2狂犬病病毒实验室检测方法

1.2.1小鼠分离病毒试验(Mouse Isolation Test, MIT)

1.2.2细胞培养分离病毒技术(Cell-culture Isolation Technique, CIT)

1.2.3 荧光抗体实验(Fluorescent Antibody Test, FAT)

1.2.4 快速狂犬病酶免疫诊断法(Rapid Rabies Enzyme Immunodetection, RREID)

1.3狂犬病病毒抗体的实验室检测方法

1.3.1 小鼠病毒中和试验(mouse neutralization test, MNT)

1.3.2 荧光抗体病毒中和试验(Fluorescent Antibody Virus Neutralization test, FAVN)

1.3.3 快速荧光灶抑制试验(Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test, RFFIT)

1.3.4 酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)

1.4本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 毒株与血清

2.1.2主要试剂及配制

2.1.3 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 菌株的复苏与PCR验证

2.2.2 目的蛋白的诱导表达与纯化

2.2.3 间接ELISA方法的建立

3 结果与分析

3.1 菌株的鉴定

3.2 蛋白诱导与纯化

3.2.1 蛋白诱导表达的情况

3.2.2 纯化后目的蛋白条带的鉴定

3.2.3 蛋白浓度测定结果

3.3 狂犬病病毒中和抗体间接ELISA方法的优化

3.3.1 封闭液的选择

3.3.2 血清稀释液的优化

3.3.3 最佳抗原浓度和最适血清浓度的确定

3.3.4 抗原包被时间的优化

3.3.5 封闭时间的优化

3.3.6 血清孵育时间的优化

3.3.7 酶标二抗稀释度的确定

3.3.8 酶标二抗孵育时间的优化

3.3.9 标准曲线方程的建立

4.1 包被蛋白的选取

4.1.1 包被病毒与包被表达蛋白的比较

4.1.2 不同毒株G基因的选择

4.1.3 表达RV G3蛋白的工程菌的优势

4.2 浓缩纯化RV G3蛋白的注意事项

4.3定量中和抗体的间接ELISA的注意事项

4.3.1 酶标板

4.3.2 封闭液和血清稀释液

4.3.3 包被

4.3.4 洗涤

4.3.5 显色

4.3.6 标准曲线

4.3.7 特异性

4.3.8 重复性

4.3.9 敏感性

全文总结

致谢

参考文献