稻瘟病抗病基因Pia与稻瘟病菌无毒基因AvrPia互作的分子机制研究

摘要

水稻是最重要的粮食作物之一，养育了全球超过50％的人口。由丝状子囊真菌稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的水稻稻瘟病是世界范围内最具破坏性的水稻病害之一。水稻-稻瘟病菌的互作关系符合经典的“基因对基因”学说，深入研究抗病基因和无毒基因间的关系既能更好地揭示宿主与病原菌间的互作机制，又能为抗病品种的选育提供新的策略。
　　稻瘟病抗病基因Pia位于水稻11号染色体，本研究室在前期研究中对其进行了定位克隆，在阐述其分子进化过程的同时，也对其与相应无毒基因 AvrPia的互作机制进行了研究分析。为进一步深入研究 Pia与 AvrPia的功能及互作模式，本研究主要开展了以下3个方面的工作，主要结果如下所示：
　　1. Pia2CC各截短蛋白的分子内互作
　　预测Pia2CC(1-229)的二级结构并将其划分为7个截短蛋白。通过Y2H系统分析互作情况。结果显示，Pia2NtNN(1-140)，Pia2NtNN(1-176)及 Pia2NtNN(1-229)都存在分子内互作，且Pia2NtNN(1-229)自身互作程度最弱。体外互作分析表明Pia2CC形成同源复合物的最小功能单位是Pia2NtNN(1-140)。
　　2. Pia1CC，Pia2CC与AvrPia的体内互作
　　前期研究证明Pia1CC，Pia2CC与AvrPia具有体外互作。为进一步确定三者的体内互作情况，本研究进行了亚细胞定位、BiFC分析及 Co-IP分析。亚细胞定位结果显示Pia2CC具有线粒体定位、核质定位及混合定位的动态变化模式，且完整的蛋白结构是 Pia2CC存在线粒体定位所必需的条件。BiFC分析显示，Pia2CC与 Pia1CC、AvrPia互作的主要场所为线粒体，Pia1CC与AvrPia的互作场所为细胞核及细胞质。Co-IP实验也证实了AvrPia与Pia1CC、Pia2CC互作。
　　3. Pia1FL，Pia2FL与AvrPia三者的功能及互作
　　为明确 Pia与 AvrPia的互作模式，本研究利用基于荧光素酶报告基因的水稻原生质体瞬时表达系统分析了三者的功能及互作关系。结果显示，R基因中只有融合NLS或NES标签的Pia2FL会发生自激活现象；AvrPia全长蛋白及成熟蛋白均能够引起类HR的细胞凋亡反应。Pia1FL能够抑制Pia2FL-NLS或Pia2FL-NES引起的自激活。同时，Co-IP分析也表明Pia1FL与Pia2FL互作。此外，LUC实验显示三基因共表达后能够触发一定程度的细胞凋亡反应，说明三基因组合存在互作。
　　综合前期研究结果，本研究证明 Pia1和 Pia2都能够以直接的方式识别效应子AvrPia。Pia1和Pia2通过各自的CC结构域直接互作并形成复合体。当病原菌入侵时，Pia1的CtNL结构域蛋白能够识别AvrPia成熟蛋白，并通过Pia1与Pia2的互作把效应子信号传递给Pia2；同时，在AvrPia信号肽的诱导作用下，Pia2核质间的运输被打断，触发下游信号转导途径，激活免疫反应。

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1 前言

1.1植物抗病性的产生

1.2水稻稻瘟病抗病基因的研究概况

1.3植物抗病蛋白亚细胞定位模式与功能的关系

1.4抗病基因与无毒基因互作的模式

1.5成对抗病基因与无毒基因的互作机制

1.6本研究的目的以及主要内容

2 材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3 结果与分析

3.1 Pia2NtNN截短蛋白的体外自身互作

3.2 Pia1CC与Pia2CC的互作分析

3.3 Pia1CC、Pia2CC(1-158)与AvrPia的体内互作

3.4 Pia1、Pia2与AvrPia三者的Co-IP互作分析

3.5 Pia1、Pia2与AvrPia三者的功能及互作分析

4 结论与讨论

4.1蛋白功能表达与结构的关系

4.2抗病蛋白亚细胞定位与功能的关系

4.3 Pia与AvrPia的互作模式

4.4本研究创新点

4.5下一步的研究设想

致谢

参考文献

附录

附录A：实验方法

附录B：本研究所用引物总表

附录C：研究期间构建载体列表