小反刍兽疫全基因序列分析与核衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达

摘要

小反刍兽疫（Pest des petits ruminants，PPR）是由小反刍兽疫病毒（Pest des petits ruminants virus，PPRV）引起的烈性传染病，其病毒主要危害山羊、绵羊等小反刍兽，以突然发病、高热稽留、口疮、流鼻涕、腹泻等主要病症，因其发病率和死亡率高，传播速度快，被世界动物卫生组织（The World Organisation for Animal Health，OIE）列为A类烈性重大传染病之一。小反刍兽疫病毒于2007年7月在我国西藏首次发现，相继在2013年新疆伊犁大爆发，引起大批量的山羊、绵羊死亡，给养殖户带来巨大损失。随后在我国20多个省、市大量流行、传播。各地的有关部门也重视了该病毒的危害性，积极采取措施预防。笔者于2014年春季在广东省某羊场送检的样本中首次检测到了小反刍兽疫病毒，并把该毒株命名为CH/GDDG/2014。本研究对其全基因组特征、N基因抗原活性等进行了研究，有助于了解小反刍兽疫病毒的分子流行病学，也为小反刍兽疫病毒的诊断研究奠定基础。本研究内容及结果如下：
　　1．本研究利用RT-PCR分11段重叠cDNA扩增小反刍兽疫病毒基因全长序列获得PPRV全基因组，并命名为CH/ GDDG/2014株，经序列测定与GenBank中收录的23条小反刍兽疫参考毒株的序列进行核苷酸同源性分析，构建系统进化树。结果显示CH/ GDDG/2014株基因组含有15954个核苷酸，获得的全长序列比国外分离的毒株要多6个核苷酸（TCCCTC），由于这6个核苷酸的插入可能导致病毒滴度降低，对细胞的培养造成一定的困难。该基因组包括六个开放阅读框（ORFs）分别编码核衣壳蛋白，磷蛋白，基质蛋白，融合蛋白，血凝素，和大聚合酶蛋白。与参考株之间的核苷酸同源性为87.2％?99.8％，其中发现CH/ GDDG/2014株与China/XJYL/2013株同源性最高（99.8％），与KN5/2011同源性最低（87.2％）。小反刍兽疫病毒CH/GDDG/2014株与国内近2年的小反刍兽疫病毒毒株均在系统进化树上处于同一分支，而与国外毒株处于不同分支。进一步表明目前国内流行的小反刍病毒亲缘关系较近，且主要以IV系流行。构建了PPRV的全长cDNA为拯救PPRV奠定了基础。
　　2．本研究成功构建了小反刍兽疫N基因的重组穿梭质粒pFastBac-PPRV-N，经测序正确，转化到DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，经过蓝白斑筛选转座后获得重组杆状病毒杆粒Bacmid-PPRV-N，转染生长良好的Sf9细胞，获取重组杆状病毒。通SDS-PAGE和WB鉴定N的蛋白的表达，且鉴定的条带与预期的相符。

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中文摘要

英文摘要

英文缩写对照表

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前言

前言一

1 小反刍兽疫概述

前言二

1 概述

2. Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统

3 杆状病毒表达系统应用进展

4：研究目的意义

第一部分：小反刍兽疫病毒CH/GDDG/2014株的全基因序列分析

引言

1 材料与方法

2 方法

3 结果与分析

4 讨论与结论

第二部分：小反刍兽疫病毒核衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达

引言

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

全文总结

致谢

参考文献

附录A: PPRV(CH/GDDG/2014毒株)全基因核酸序列测序结果：

附录B：pMD19-T Simple Vector图谱：

附录C：pFastBacTMHTA Vector图谱：

附录D:攻读硕士期间发表的相关学术论文：