IBD VP2 DNA疫苗及鸡Akirin2和GM-CSF对其免疫调节效果的研究

摘要

Akirins是天然免疫信号通路TLR所必须的核蛋白，调控依赖NF-κB的基因转录，在免疫和炎症反应中不可或缺，是极具潜力的免疫增强基因。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）是新一代分子免疫佐剂，能活化树突状细胞，增强其抗原递呈能力，提高机体免疫应答水平。传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）VP2基因编码病原的主要结构和抗原蛋白VP2，是研制IBD DNA疫苗的重要靶基因。本试验优化合成了鸡（Gallus）Akirin2和GM-CSF基因，研究了它们对IBD VP2 DNA疫苗的免疫调节效应，具有重要的学术价值和应用前景，主要研究内容包括：
　　1.参照GeneBank已发表的IBDV VP2（AF508177）、Gallus Akirin2（NM_001193595）和Gallus GM-CSF（EU939770.1）基因序列，优化合成三者编码区核苷酸序列，利用连接肽串联后克隆至 pTriEx-4，构建 VP2、Akirin2和 GM-CSF三表达重组质粒pVP2-Akirin2-GM-CSF。体外转染293T细胞进行瞬时表达，48 h后通过SDS-PAGE和Western blot技术可检测到目的蛋白的表达，大小分别为58 kDa、36kDa和22 kDa左右，证明该重组质粒可以用作DNA疫苗免疫。试验中同时成功构建五种对照重组质粒：pVP2、pAkirin2、pGM-CSF、pVP2-Akirin2和pVP2-GM-CSF。
　　2.将pVP2重组质粒作为转移载体与BacMagic-3 DNA构建重组杆状病毒Bac-VP2，感染Sf9细胞后以IBD标准阳性血清作为一抗进行间接免疫荧光试验，能够检测到特异性荧光。大量提取蛋白并经镍柱亲和层析，作为抗原包被酶标板制备VP2抗体ELISA检测方法，经IBD标准血清检测，证明其灵敏性、重复性良好；经鸡马立克（MD）、禽白血病（AL）、禽网状内皮组织增生症（RE）、禽流感（AI）、鸡新城疫（ND）阳性血清检测，证明其特异性良好。
　　3.将pVP2-Akirin2-GM-CSF重组质粒作为DNA疫苗免疫14日龄SPF鸡，28日龄加强免疫，42日龄以IBDV BC6-85强毒株攻击，攻毒96 h后剖检，统计得疫苗保护率为85％，高于pVP2组（55%）、pVP2-Akirin2组（75%）和pVP2-GM-CSF组（70%）。分别于14日龄、28日龄、42日龄和46日龄翅下静脉采血检测血清VP2抗体和中和抗体水平。结果显示，随着免疫次数和时间的增加，pVP2-Akirin2-GM-CSF组VP2抗体水平和中和抗体滴度均持续上升，42日龄时，VP2抗体水平（S/P）值达到1.016，均高于pVP2组（S/P=0.771，p＜0.01)、pVP2-Akirin2组（S/P=0.973，p＞0.05)和pVP2-GM-CSF组（S/P=0.836，p＜0.01)；IBDV中和抗体滴度达到1:4298，极显著高于 pVP2组（1:2057，p＜0.01）、pVP2-Akirin2组（1:3514，p＜0.01）和pVP2-GM-CSF组（1:2557，p＜0.01)。MTT法检测42日龄时外周血淋巴细胞增殖能力，pVP2-Akirin2-GM-CSF诱导的增殖指数均显著高于其余各重组质粒组（p＜0.05)。ELISA检测42日龄pVP2-Akirin2-GM-CSF组试验鸡血清IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6的平均浓度，结果表明，IFN-γ、IL-2和IL-6浓度明显上调，IL-4浓度明显下调，与其余各组均有差异。表明pVP2-Akirin2-GM-CSF重组质粒免疫后能诱导试验鸡产生强烈的体液免疫应答和细胞免疫应答。

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1.前言

1.1 IBD病原学研究进展

1.2 IBD疫苗

1.3 我国IBD防控中的问题

1.4 细胞因子免疫调节剂

1.5 Akirins研究进展

1.6 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）在疫苗研发中的应用

1.7 杆状病毒表达系统

2. 材料和方法

2.1主要仪器和试剂

2.2 基因优化与合成

2.3 引物设计与合成

2.4 VP2、Akirin2和GM-CSF共表达重组质粒pVP2-Akirin2-GM-CSF的构建

2.5 重组质粒pVP2、pAkirin2、pGM-CSF、pVP2-Akirin2和pVP2-GM-CSF的构建

2.6 His-VP2融合蛋白的制备

2.7 间接ELISA检测血清VP2抗体方法的建立

2.8 重组质粒体外表达

2.9 攻毒保护试验

2.10 数据统计

3. 结果

3.1 PCR扩增结果

3.2 重组质粒双酶切鉴定结果

3.3重组杆状病毒Bac-VP2的IFA鉴定结果

3.4 His-VP2蛋白SDS-PAGE和Western blot鉴定结果

3.5 重组质粒在293T细胞中的表达结果

3.6 间接ELISA检测血清VP2抗体水平检测方法的建立

3.7 攻毒保护试验结果

3.8 抗体水平检测结果

3.9外周血淋巴细胞增殖试验（MTT法）结果

3.10血清IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6浓度检测结果

4 讨论

4.1目的基因的确定

4.2 真核表达载体的确定

4.3 IBDV VP2抗体ELISA检测方法的建立

4.4 IBD DNA疫苗免疫保护力评价

4.5 Akirin2和GM-CSF对VP2 DNA疫苗佐剂效应分析

5. 结论

致谢

参考文献

附录