原花青素和EGCG在Marc-145细胞中对猪繁殖与呼吸综合征病毒的抑制作用研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以猪的呼吸道症状、新生仔猪的高死亡率以及母猪繁殖障碍为特征的传染病，对全球范围内的养猪业产生严重的危害。PRRS于1987年首次在美国被发现，我国于1996年分离出PRRSV毒株。在2006年，我国爆发了高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS），并迅速传播至东南亚，造成了巨大的经济损失。近年来，PRRS一直是危害我国养猪业的主要病毒感染性疾病。目前防治PRRS的主要手段是疫苗免疫，但是PRRSV的易变异性及疫苗的安全性导致疫苗接种预防的效果并不理想，而至今尚无被批准的防治PRRS的药物。因此，发展防控PRRS的新策略以及开发新型抗PRRSV药物变得尤为紧迫。
　　我国传统的中医药在病毒性疾病防治上发挥着重要的作用，从天然药物中寻找抗PRRSV的药物是一条重要途径。原花青素（Procyanidin）和表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）均属于茶多酚类化合物，具有抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药理活性，其中以抗氧化活性被人们所熟知，目前已广泛应用于食品、化妆品、保健品等领域。本文对原花青素和EGCG体外抗PRRSV的活性进行了评价，并对其作用机制进行初步研究。
　　本研究建立了PRRSV感染Marc-145细胞模型，运用间接免疫荧光试验的方法，从11种茶多酚类化合物中筛选出2种对PRRSV具有显著抗病毒活性的化合物—原花青素和EGCG，在此基础上对两种药物开展了系统的药效评价。病毒的mRNA和蛋白的合成水平分别采用荧光定量PCR、Western blot等方法测定。测定了原花青素和EGCG在感染后48 h的抗PRRSV药效，以及感染后48 h内不同时间点的药效，还研究了药物对PRRSV增殖的吸附、内化、复制、释放等不同阶段的抑制效果，由此初步阐述原花青素和EGCG的抗PRRSV作用机制。
　　试验结果表明，在感染后48 h，原花青素和EGCG在5~40μg/mL的浓度范围内呈剂量依赖性地显著抑制PRRSV的增殖，并且40μg/mL的原花青素抑制效果优于40μg/mL的利巴韦林。在感染后6~48 h内的不同时间点，40μg/mL的原花青素和EGCG均能有效抑制PRRSV的NSP9 mRNA和N蛋白的合成，在第48 h时抑制效果优于40μg/mL的利巴韦林。原花青素和EGCG在5~40μg/mL的浓度范围对PRRSV的吸附、内化和释放的过程有明显的抑制效果，且呈剂量依赖性；而40μg/mL的原花青素和EGCG对PRRSV的合成和组装阶段有显著的抑制作用。将药物与PRRSV直接作用，结果发现，5~40μg/mL的原花青素和EGCG均能使PRRSV感染Marc-145细胞的能力下降，呈剂量依赖性；而药物与Marc-145细胞的预作用，则无法阻止PRRSV感染细胞。
　　本文首次发现原花青素具有体外抗PRRSV作用，并探讨了原花青素和EGCG体外抗PRRSV的作用机制是通过抑制PRRSV病毒粒子本身以及抑制PRRSV增殖的吸附、内化、复制和释放阶段而发挥抗病毒作用。本文为新型抗猪繁殖与呼吸综合征药物的研发提供了初步的实验依据。

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1 前言

1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒及其危害

1.2 猪繁殖与呼吸综合征的防治技术

1.3 原花青素、EGCG的研究概况

1.4 本论文研究目的及意义

2 材料与方法

2.1主要药物与试剂

2.2 病毒与细胞株

2.3 主要仪器

2.4 常用试剂配制

2.5 方法

2.6 试验数据处理

3 结果与分析

3.1 PRRSV对Marc-145细胞TCID50试验结果

3.2抗PRRSV活性药物筛选试验结果

3.3 PC、EGCG对Marc-145细胞活力的影响

3.4 PC、EGCG对PRRSV增殖的抑制作用

3.5 PC、EGCG阻断PRRSV对Marc-145细胞的吸附

3.6 PC、EGCG阻断PRRSV的细胞内化

3.7 PC、EGCG对PRRSV的直接抑制作用

3.8 PC、EGCG处理不影响Marc-145细胞的PRRSV受体

3.9 PC、EGCG抑制PRRSV在Marc-145细胞中的合成及装配

3.10 PC、EGCG抑制PRRSV的释放

4 讨论

全 文 总 结

致谢

参考文献