石斑鱼NADPH氧化酶和髓过氧化物酶基因鉴定及其分子特征

摘要

中性粒细胞是一种重要的吞噬细胞，其被激活后产生大量的活性氧物质（Reactive Oxygen Species，ROS），这些 ROS通过氧化作用快速而高效的杀灭病原体，构成机体非特异性免疫的第一道防线。NADPH氧化酶是细胞内ROS的主要来源，它能将O2还原成O?2, O?2经歧化作用生成H2O2。髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）主要存在于中性粒细胞的胞浆颗粒中，能够催化 H2 O2与卤素反应生成氧化性更强的次卤酸，从而发挥抗微生物活性。刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）是一种危害极大的寄生性海水纤毛虫，给海水养殖业带来了巨大的经济损失。研究证实刺激隐核虫感染能够引起鱼类的免疫反应，但其具体机制有待进一步阐明。为了探究中性粒细胞是否参与斜带石斑鱼（Epinephelu s coio ides）抗刺激隐核虫感染的过程及其可能的机制，本文基于斜带石斑鱼的转录组数据，克隆了其吞噬细胞N ADP H氧化酶复合体的5个亚基基因（gp91phox、p22phox、p67phox、p47phox、p40phox）和MPO基因，并分析了这些基因在刺激隐核虫感染后的表达情况；此外，论文还表达了MPO部分区段，制备了兔抗斜带石斑鱼MPO多克隆抗体，通过检测刺激隐核虫感染后鳃组织中的MPO阳性细胞数，探究MPO阳性细胞的迁移和聚集情况。实验的主要结果如下：
　　1.克隆得到了斜带石斑鱼gp91phox、p22phox、p67phox、p47phox、p40phox和MPO共6个基因的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）序列，长度分别为1698 bp、564 bp、1497 bp、1290 bp、1050 bp和2313 bp，分别编码565、187、498、429、349和770个氨基酸；进化分析表明它们与鱼类和哺乳动物的对应蛋白在进化上同源。
　　2.定量分析显示：健康石斑鱼中，这6个基因在免疫相关组织中的表达量高于非免疫组织；刺激隐核虫感染后，这些基因的表达量在皮肤、鳃、脾脏和头肾等4个组织中均出现了不同程度的上调，提示这些基因可能参与了石斑鱼抗刺激隐核虫感染的过程。
　　3.成功地表达了石斑鱼 MPO部分序列，并以此为抗原免疫新西兰兔制备了兔抗石斑鱼MPO多克隆抗体，该抗体能够很好的识别石斑鱼天然MPO蛋白；利用该抗体进行免疫组化，发现刺激隐核虫感染后的鳃中，MPO阳性细胞数量显著增加，并在刺激隐核虫滋养体附近聚集，提示中性粒细胞参与了宿主抗刺激隐核虫感染的过程，并可能通过产生ROS杀伤滋养体。

目录

声明

1 前言

1. 1 中性粒细胞在机体免疫应答中的作用

1. 2 中性粒细胞主要的杀伤机制

1.2.1 中性粒细胞胞浆颗粒

1.2.2 NADPH氧化酶

1.2.3 髓过氧化物酶

1.2.4中性粒细胞胞外诱捕网

1. 3研究的目的及意义

2. 1 实验材料

2.1.1 斜带石斑鱼

2.1.2 刺激隐核虫

2.1.3 主要试剂和器材

2. 2 实验方法

2.2.1 刺激隐核虫感染石斑鱼

2.2.2石斑鱼组织样品的采集

2.2.3 石斑鱼组织总RNA的提取

2.2.4 一链cDNA的合成

2.2.5基因的克隆

2.2.6基因表达分析

2.2.7 MPO片段的原核表达

2.2.8抗石斑鱼MPO多克隆抗体的制备

2.2.9抗石斑鱼MPO多克隆抗体特异性检测

2.2.10免疫组织化学

2.2.11数据分析

3 结果

3. 1 基因的序列分析

3.1.1 NADPH氧化酶5个亚基序列分析

3.1.2 MPO序列分析

3. 2 基因的组织分布

3. 3 刺激隐核虫感染对NADP H氧化酶和MPO表达的调节作用

3.4 MPO片段的原核表达与多抗制备

3.4.1 原核表达载体的构建与重组蛋白的表达

3.4.2 融合蛋白的纯化

3.4.3 多克隆抗体特异性的检测

3. 5 免疫组织化学

3.5.1 血涂片中MPO阳性细胞的检测

3.5.2 刺激隐核虫感染后石斑鱼鳃中的MPO阳性细胞

4. 讨论

4. 1 石斑鱼NADP H氧化酶和MPO序列分析

4. 2 石斑鱼NADP H氧化酶和MPO基因的组织分布

4. 3 石斑鱼NADP H氧化酶与MPO在抗刺激隐核虫感染中的作用

4. 4 全文总结与展望

4.4.1 全文总结

4.4.2展望

致谢

参考文献

附录