香蕉CMV和BBTV检测方法的建立及其含量变化的研究

摘要

香蕉（Musa spp.）为单子叶草本植物，属于芭蕉科（Mu saceae）芭蕉属（Musa），是仅位于水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食作物，世界上鲜果消费量和贸易量最大的热带水果之一。然而，黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus，BBTV）病害大规模爆发和流行已成为限制香蕉大量生产的主要因素之一，也严重影响了香蕉产业的发展。因此本研究主要通过建立香蕉CMV和BBTV检测的组织免疫印迹技术和明确这两种病毒在巴西蕉不同部位及不同时间的相对含量变化两方面内容，为有效防控病害奠定基础。
　　本研究利用SYBR Green实时荧光定量PCR中的绝对定量技术，对香蕉样品叶片中的CMV和BBTV进行了准确的定量，确定CMV和BBTV实时荧光定量PCR反应条件的合理性及检测方法的可靠性；应用CMV和BBTV的单克隆抗体，建立了快速检测田间样品的组织免疫印迹技术(Tissue blot immunobiding assay，TBIA)；明确了巴西蕉不同部位及不同季节CMV和BBTV的相对含量变化，结果如下：
　　1、依据CMV的CP基因序列和BBTV的Rep基因的保守序列分别设计了实时荧光定量PCR的特异性引物，对克隆的阳性质粒进行一系列的梯度稀释,然后选择6个稀释的梯度作为模板构建标准曲线，确定CMV和BBTV实时荧光定量PCR反应条件的合理性及检测方法的可靠性；本实验定量香蕉样品1-1、1-2和1-3叶片所包含的CMV的拷贝数分别为1.10×1010 copies/μL、6.84×109copies/μL和1.00×1010 copies/μL，BBTV香蕉样品2-1、2-2和2-3的拷贝数分别为4.40×1010copies/μL、1.88×108copies/μL和4.17×108copies/μL。
　　2、TBIA法可以很好的检测出0.1 g香蕉叶片中CMV含量为109级别的拷贝数，BBTV含量为1010级别的拷贝数，与LAMP/RT-LAMP检测方法相比，灵敏度不高；在稳定性方面，样品印迹在PVDF膜上，然后保存至4℃环境内2个半月以上，其仍可以稳定的检测出香蕉中的CMV和BBTV，具有很好的稳定性。
　　3、在巴西蕉的不同部位，CMV相对含量从上叶、中叶到下叶都是呈依次递减；BBTV相对含量上叶均高于下叶，整体呈递减趋势，个别月份中叶高于上叶，下叶高于中叶。在不同季节（2016年8~12月份及2017年1月份），CMV相对含量在整体呈现先增高后下降，再增高下降的变化趋势；BBTV相对含量整体呈现先增加后下降的趋势。
　　另外，本研究进一步评价了 TBIA法、LAMP/RT-LAMP法和 PCR/RT-PCR法检测田间香蕉样品的效果，这在实际的生产实践中，特别是在植物病毒防治方面具有重大意义。

目录

声明

缩写词及英汉对照

1前言

1. 1香蕉病毒病害的概况

1.2 香蕉CMV和BBTV两种病毒的生理学特征及病理学特性

1.2.1 黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）

1.2.2 香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus，BBTV）

1. 3分子生物学检测

1.3.1 实时荧光定量PCR技术

1.3.2 环介导等温扩增技术

1. 4 血清学检测技术

1. 5 本研究的目的与意义

2. 1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株及抗血清

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器

2.1.5 主要试剂的配制

2.1.6 数据分析

2. 2 实验方法

2.2.1 RNA提取用具的处理

2.2.2 感染CMV病毒的香蕉叶片总RNA的抽提

2.2.3感染BBTV病毒的香蕉叶片总DNA的抽提

2.2.4 实时荧光定量PCR标准曲线的制作

2.2.5 病毒CMV和BBTV的实时荧光定量

2.2.6 LAMP（RT-LAMP）检测

2.2.7 组织免疫印迹检测

2.2.8 间接ELISA（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测

3. 1 香蕉叶片总DNA及R NA的抽提

3.2 香蕉叶片 CMV和BBTV 含量的检测

3.2.1 CMV和BBTV标准曲线标准品的制备

3.2.2 实时荧光定量PCR检测体系的建立

3.2.3 三个香蕉样品叶片的CMV含量分析

3.2.4 香蕉叶片的BBTV含量分析

3.3 TBIA法和LAMP法检测香蕉病株的灵敏度分析

3.3.1 TBIA法一抗、二抗最适稀释度选择

3.3.2 比较TBIA法和RT-LAMP法检测香蕉CMV病株的灵敏度

3.3.3 比较TBIA法和LAMP法检测香蕉BBTV病株的灵敏度

3.4 TBIA法检测香蕉病株的稳定性分析

3.4.1 TBIA法检测香蕉CMV病株的稳定性分析

3.4.2 TBIA法检测香蕉BBTV病株的稳定性分析

3.5TBIA法、LAMP法和PCR/RT-PCR法田间样品检测效果评价

3.5.1 比较TBIA法、RT-LAMP和RT-PCR法检测CMV病株

3.5.2 比较TBIA法、LAMP法和PCR/RT-PCR法检测BBTV病株

3.6 巴西蕉CMV和BBTV含量的变化

3.6.1 巴西蕉不同部位CMV和BBTV的相对含量变化

3.6.2 巴西蕉不同季节CMV和BBTV病毒的相对含量变化

4. 1 讨论

4.1.1 香蕉叶片CMV和BBTV实时荧光定量PCR定量分析

4.1.2 CMV和BBTV检测方法的研究

4.1.3 巴西蕉CMV和BBTV相对含量的变化分析

4. 2 结论

致谢

参考文献