薇甘菊萎蔫病毒侵染薇甘菊叶片不同时间的转录组分析

摘要

薇甘菊（Mikania micrantha H.B.K）是入侵我国华南地区的主要外来有害植物之一。目前，控制薇甘菊生物入侵的方法主要有人工清除、化学防治和生物防治。但这些方法成本高且使用范围小、将其真正应用到实践中仍需做大量深入的研究工作；随着近年来新一代高通量测序技术的发展，利用转录组测序技术研究不同条件或不同细胞类型样品中基因表达情况正成为重要的实验手段。本研究以外来入侵杂草薇甘菊为研究对象，通过摩擦接种薇甘菊萎蔫病毒(Mikania micrantha wilt virus, MMWV)侵染薇甘菊叶片不同时间的转录组测序分析，阐明薇甘菊对MMW V侵染的分子响应机制，揭示与MMWV致病相关的功能基因，为更深入地了解、利用和控制MMWV奠定基础，同时为利用MMW V研发防控薇甘菊入侵的新方法提供重要的理论依据。本研究主要研究结果如下：
　　1. MMWV侵染薇甘菊不同时间测序文库构建及高通量测序和组装
　　本研究将MMWV侵染薇甘菊分别15天、30天、正常对照(不侵染)处理后，以Illumina HiSeq2000为测序平台进行转录组测序分析，最终得到的Clean Reads约有1.39×108 bp，再通过Trinity软件进行序列3个样品的Clean Reads从头拼接组装，总共得到总的组转出来的潜在转录本为169497条，总的组装出来的潜在基因为121379个。有10960个基因可以同时得到Uniprot、NR、NT数据库的注释。Unigene功能分类研究中，使用GO分类，在生物过程分类中，薇甘菊unige ne所参与的GO分类主要是细胞过程和代谢过程，在细胞组分的分类中，参与细胞部分的unige ne所占的比例最高，在分子功能分类中，具有结合和催化活性功能的基因所占的比例最高。将所有Unigene和COG数据库进行比对，其中种类全面，数量最多的是整体功能类的基因，有2425条；其次为复制、重组和修复和翻译、核糖体结构和生物转化、翻译后修饰、蛋白代谢等类别。
　　2. MMWV侵染薇甘菊不同时间段差异表达基因特征分析
　　两两比较感染不同时间段下的基因表达情况，与正常对照组相比，侵染15天和30天条件下差异表达的基因数目分别为356和18272个，这其中有87个分布在两两对比中的交叉区域，即侵染15天和30天都出现差异表达的基因，有56个上调表达，13个下调表达。在此基础上，重点讨论了响应 MMW V侵染的相关参与基因的适应机制，侵染15天后，不饱和脂肪酸生物合成的5个基因上调表达，细胞周期的4个基因出现下调表达；侵染30天后，转运蛋白的164个基因出现上调表达，1个基因出现下调表达；植物-病原互作的67个基因上调表达，17个基因下调表达。这些活动可能与植物的生长发育、抗性、调控防御反应有关。
　　3.实时荧光定量PCR分析
　　利用实时荧光定量 PCR对侵染 MMWV5天、10天、15天、20天、25天和30天处理前后的差异表达基因表达变化进行分析，选取了4个与植物次生代谢相关的基因即多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)、查尔酮合成酶(chalcone synthase， CHS)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase， APX)和二氢黄酮醇4-还原酶(d ihydro fla vo no l4-red ucta se，DF R)，由荧光定量结果可以看出，M MW V侵染显著诱导薇甘菊防御反应、抗性相关的基因表达量增加了。实时荧光定量分析结果与转录组分析结果基因的表达趋势基本一致，验证了MMW V侵染对薇甘菊的抑制作用。
　　综上，通过对转录组测序结果的差异分析，本研究得到了薇甘菊 MMW V感染条件下差异显著性表达的基因87个，有56个上调表达，13个下调表达；差异显著性表达的富集通路48条，主要富集在与植物防御反应、次生代谢等相关的通路；并经实时荧光定量验证表明转录组测序结果完全可信。该项研究为揭示薇甘菊响应MMWV胁迫的分子机制提供了一定的依据。

目录

声明

1前言

1. 1薇甘菊研究进展

1.1.1薇甘菊的特性

1.1.2薇甘菊的分布、扩散、危害

1.1.3薇甘菊防治现状

1. 2薇甘菊萎蔫病毒概述

1. 3生物入侵的转录组学研究

1.3.1转录组学简介

1.3.2第二代测序技术在入侵生物转录组学的应用

1. 4本研究的目的、内容及意义

2薇甘菊萎蔫病毒侵染薇甘菊不同时间测序文库构建及高通量测序和组装

2. 1实验材料

2.1.2病毒接种

2. 2实验方法

2.2.1薇甘菊个体总RNA的提取及检测

2.2.2文库构建和上机测序

2.2.3原始数据整理、过滤及质量评估

2.2.4组装

2.2.5 Unigene功能注释

2.2.6 Unigene功能聚类分析

2. 3结果与分析

2.3.1表型鉴定

2.3.2薇甘菊RNA质量检测

2.3.3薇甘菊原始数据整理、过滤及质量评估

2.3.4组装与评估

2.3.5编码蛋白框的预测

2.3.6薇甘菊unigene功能分类

2. 4小结

3薇甘菊感染薇甘菊萎蔫病毒不同时间段后基因差异表达特征分析

3. 1实验材料

3. 2实验方法

3.2.1薇甘菊Unigene的表达量及表达差异分析

3.2.2薇甘菊差异表达Unigene的富集分析

3.2.3实时定量荧光PCR分析

3. 3结果与分析

3.3.1薇甘菊Unigene序列表达丰度分析

3.3.2薇甘菊感染MMWV不同时间段差异表达基因筛选

3.3.3薇甘菊差异表达基因聚类分析

3.3.4实时荧光定量PCR结果分析

3. 4小结

4结论

5展望

致谢

参考文献

附录