家蚕抗菌肽DefensinB的抑菌活性和品种间的序列差异分析

摘要

抗菌肽（Antibmicrobial peptides）是体液免疫中产生的效应分子，在昆虫的免疫防御中起重要作用。家蚕是一种重要的经济昆虫，也是鳞翅目昆虫的模式代表，其免疫机制的研究备受关注。根据抗菌肽的结构和功能特点，家蚕中的抗菌肽被分为7个家族，其中Cecropin、Attacin、Lebocin、Moricin、Enbocin和Gloverin6个家族抗菌肽的功能和活性已有报道，而 Defensin家族的两个抗菌肽成员 DefensinA和DefensinB的功能尚未得到鉴定，仍有待进一步研究。
　　论文首先通过杆状病毒真核表达系统表达家蚕抗菌肽DefensinB，检测重组蛋白DefensinB的抑菌活性；其次，从不同家蚕品种扩增DefensinB的基因序列，分析品种间的序列差异，并进一步检测细菌和真菌诱导后不同品种中家蚕DefensinB基因的转录表达情况。研究获得以下主要结果：
　　1、以家蚕幼虫脂肪体cDNA为模板，通过RT-PCR扩增得到C端带有His.tag的DefensinB编码序列，酶切连接到pFastBac1载体，成功构建pFastBac1-DefensinB重组载体，利用Bac-to-Bac系统转化至E. coli AcDH10Bac中，通过PCR检测筛选出重组Bacmid-DefensinB。转染Sf9细胞，得到P1代重组杆状病毒，经扩增繁殖得到P2代、P3代病毒。以P3代病毒感染无血清培养的Sf9细胞，培养7d后收集培养液上清和Sf9细胞，Western blot结果显示在培养基上清中和Sf9细胞内均存在DefensinB重组蛋白，通过Ni-IDA亲和层析柱纯化得到重组蛋白DefensinB。
　　2、采用琼脂板孔穴扩散法和生长曲线法，体外检测重组蛋白DefensinB的抑菌活性，结果显示重组蛋白对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli K12D31）没有抑菌活性，也没有检测到对粗糙脉孢菌（ Neurospora crassa）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）等供试真菌的抑菌活性。
　　3、以大造、琼山海南、932、秋丰、芙蓉、7532、白玉、湘晖的家蚕基因组DNA为模板，PCR扩增DefensinB的基因序列，电泳检测结果显示不同家蚕品种中扩增的DefensinB基因大小不同，测序结果显示内含子的大小和序列均存在差异，同时DefensinB的编码序列也有差异，成熟肽区域只有一个氨基酸的差异。
　　4、以S. aureus、E. coli K12D31和白僵菌（Beauveria bassiana）对五龄第三天的家蚕幼虫进行免疫诱导，8h后取幼虫脂肪体检测DefensinB基因的转录活性，qRT-PCR 结果显示不同品种中DefensinB的基础转录水平不同，对不同微生物的应答也存在明显差异，可能与不同品种中上游启动子序列有关。另外，差异的内含子序列是否与转录应答差异有关也需要进一步研究探讨。
　　上述研究结果表明，家蚕DefensinB能响应不同病原微生物的感染，且不同家蚕品种中DefensinB基因的基础转录、免疫诱导活性均有差异。通过杆状病毒系统在Sf9细胞中表达DefensinB重组蛋白，体外抑菌试验显示重组蛋白对供试菌无抑菌活性， DefensinB的功能还需进一步研究。上述研究结果为抗菌肽的真核表达与研发做了尝试性的探索；为进一步研究DefensinB基因的表达调控和分子进化等研究奠定基础。

目录

声明

论文缩写词中英文对照

1 前言

1.1家蚕的体液免疫

1.2昆虫Defensin的研究概况

1.3 本论文的研究目的和意义

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1家蚕与其他鳞翅目昆虫Defensin序列的比对分析

3.2 家蚕DefensinB 基因PCR扩增

3.3 重组表达载体的构建

3.4 重组杆状病毒的获得

3.5杆状病毒感染的Sf9细胞的病变分析

3.6重组蛋白DefensinB的表达鉴定

3.7 DefensinB蛋白的大量纯化

3.8 DefensinB蛋白的抑菌活性

3.9 不同品种的家蚕DefensinB序列分析

3.10不同家蚕品种DefensinB的转录活性

4 讨论

4.1抗菌肽的重组表达策略

4.2 DefensinB蛋白的抑菌活性

5 结论

致谢

本论文研究受到以下项目的资助

参考文献

附录