喹诺酮类抗菌药物残留和耐药性及菌群的相关性研究

摘要

在畜牧养殖业上，抗菌药物主要用于预防治疗感染疾病，同时也作为饲料添加剂用于动物的促生长。中国每年约生产21万吨的抗菌药物，其中46.1%用于畜牧业生产。抗菌药物进入畜禽体内后并不能被机体完全吸收，其中30%-96%会以药物原形排出体外，致使粪便中有较高的药物残留，而后通过施肥等活动残留药物会进一步转移到环境中去；加之医院和工厂污水废水的不规范排放，环境中抗菌药物的污染情况日益严重。研究显示，环境中四环素类药物和磺胺类药物不仅会影响耐药细菌以及耐药基因（antimicrobial resistance genes, ARGs）的发生发展，还会影响环境微生物群落的构成。然而，关于药物的残留量对环境和肠道细菌的耐药性和菌群组成是否有影响、如何影响等问题尚不明确。本文旨在对猪场中抗菌药物残留和耐药基因流行现状进行调研，并分析两者相关性；探究环境中残留量较高的抗菌药物对环境本身以及动物肠道内细菌耐药性和微生物群落的影响。
　　应用液相色谱串联质谱法测定猪场猪粪中以及土壤中21种抗菌药物的残留浓度，并利用荧光定量 PCR检测猪场猪粪以及土壤中质粒介导喹诺酮类药物耐药（Plasmid-mediated quinolone resistance, PMQR）基因相对丰度，同时对喹诺酮类药物残留浓度与PMQR基因相对丰度进行相关性分析。结果显示，在猪场猪粪以及土壤中均检出抗菌药物残留，且均以金霉素、四环素、土霉素和替米考星残留量最高。猪场土壤中抗菌药物的检出率表现为喹诺酮类药物>四环素类药物>大环内酯类药物>磺胺类药物>截短侧耳素类药物，其中喹诺酮类药物中环丙沙星检出率最高，最高检出浓度为25.75μg/kg，最小检出浓度为2.18μg/kg，平均检出浓度为11.47μg/kg，检出率为100%。利用实时荧光定量PCR对猪粪以及土壤进行PMQR基因相对丰度检测，结果显示，猪粪中 qnrS和 aac(6’)-Ib-cr基因相对丰度较高，土壤中 qnrS、oqxB以及aac(6’)-Ib-cr基因相对丰度较高。对猪粪和土壤中PMQR基因相对丰度和喹诺酮药物残留浓度进行归一化处理和相关性分析得到，qnrS和oqxB与恩诺沙星、依诺沙星、沙拉沙星、环丙沙星以及诺氟沙星呈显著正相关；aac（6’）-Ib-cr与依诺沙星和环丙沙星呈显著正相关性。实验表明，猪场猪粪和土壤中有较严重的抗菌药物残留以及PMQR基因污染，且检出的PMQR基因与喹诺酮类药物残留呈显著正相关性。
　　由此，本实验继续研究了环丙沙星对土壤中细菌耐药性变化及微生物群落结构改变的影响。将不含药的空白土壤和猪粪混合均匀并分成四组，每组设置三个重复，分别添加治疗浓度（4 mg/kg）、土壤中高残留浓度（0.4 mg/kg）和土壤中低残留浓度（0.04 mg/kg）的环丙沙星作为处理组，对照组中不添加任何抗菌药物。在第0，30和60天时采集粪土样品，利用高通量16S rRNA测序方法分析各组中土壤微生物群落构成变化，应用实时荧光定量PCR方法检测各组中PMQR基因相对丰度，再用标准微生物培养法检测耐药细菌比例的变化情况。结果显示，不同时期各个组中均有qnrS, oqxA和aac(6’)-lb-cr检出，在0~60天内PMQR基因均呈下降趋势。与治疗组和对照组相比，残留组中PMQR基因的相对丰度消除率要小且差异显著（p<0.05）。另外，在0~60天中，所有组环丙沙星耐药菌的比例均呈下降趋势，但在30天和60天时，残留组中耐药菌比例要显著高于治疗组和对照组（p<0.05）。对土壤微生物群落结构分析得到，不同浓度的环丙沙星对土壤中的微生物结构的影响不同：低残留浓度的环丙沙星对土壤中目水平的Xanthomonadales和Bacillales以及属水平的Agrobacterium、Bacillus Enterococcus和Burkholderia具有显著的选择性。本实验表明，土壤中低残留浓度的环丙沙星可以延缓耐药基因以及耐药细菌的消除，且有利于耐药细菌以及致病菌的筛选。
　　基于以上结果，本实验后续研究了水体中不同浓度的环丙沙星对罗非鱼肠道细菌耐药性以及微生物群落结构的影响。首先将健康的罗非鱼随机等量分成四组，分别向水中添加治疗浓度（10 mg/L，A）、水体高残留浓度（1 mg/L，B）和水体低残留浓度（0.1 mg/L，C）的环丙沙星作为处理组，对照组无药物添加。分别在实验第0、7、14、21、28和35天采集罗非鱼肠道内容物，应用标准微生物培养法检测肠杆菌和气单胞菌以及相应耐药细菌的变化；同时提取肠道内容物DNA，应用实时荧光定量PCR检测PMQR基因相对丰度变化，再用16S rRNA微生物多样性测序法检测罗非鱼肠道微生物群落结构的变化；在第35天时分离并纯化气单胞菌进行药敏实验、PMQR、一类整合子、QRDR和毒力基因的检测。PMQR相对基因丰度结果显示，第35 d时，与对照组相比，所有处理组中检出的PMQR和Int I基因均呈上升趋势。气单胞菌和肠杆菌数量变化结果显示，在第0天时，处理组和对照组中气单胞菌、耐药气单胞菌、肠杆菌以及耐药肠杆菌数量大体一致，但第35天时，治疗和高残留组中气单胞菌和肠杆菌数量显著小于对照组（p<0.05），且与对照组相比，处理组中耐药气单胞菌和耐药肠杆菌均呈上升趋势。对气单胞菌进行药敏实验结果显示，所有组中气单胞菌均对萘啶酸呈高水平耐药，对照组中气单胞菌对环丙沙星和恩诺沙星敏感，治疗组中气单胞菌对环丙沙星和恩诺沙星呈高水平耐药而两个残留组则呈低水平耐药。对气单胞菌进行PMQR基因检测结果显示，治疗组中PMQR基因检出率最高，其次为高残留组。对气单胞菌进行QRDR突变检测结果显示，对照组中仅检出gyrA S83V单突变，而处理组中不仅检出gyrA S83I单突变，另外还检出gyrA S83I和parC S87I双突变。对气单胞菌进行毒力基因检测结果显示，治疗组中毒力基因检出率最高。对罗非鱼肠道微生物群落构成分析结果显示，与对照组相比，低残留组中微生物多样性没有显著变化，而治疗和高残留组则显著下降（p<0.05）；鱼肠道微生物在门水平上主要是由Fusobacteria、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria和Firmicutes组成，属水平上主要由Cetobacterium组成，Actinobacteria除了在低残留组和对照组中上升外，在治疗和低残留组中均下降。本实验表明，水中治疗浓度以及高残留浓度和低残留浓度的环丙沙星均对肠道细菌耐药性有促进作用，且治疗和高残留浓度的环丙沙星可以降低鱼肠道微生物多样性，降低核心菌群丰度；而低残留浓度的环丙沙星对微生物多样性影响不显著。
　　综上所述，猪场猪粪和土壤中有较严重的抗菌药物残留以及PMQR基因污染，且检出的PMQR与喹诺酮类药物呈显著正相关性。土壤中低残留浓度的环丙沙星可以延缓耐药基因以及耐药细菌的消除，且有利于耐药细菌以及致病菌的筛选。水体中治疗浓度、高残留浓度和低残留浓度的环丙沙星均对肠道细菌耐药性有促进作用，且治疗浓度以及高残留浓度的环丙沙星可以降低鱼肠道微生物多样性，降低核心菌群丰度；而低残留浓度对微生物多样性影响不显著。

目录

声明

缩 略 词

第一章 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的以及意义

1.3 技术路线

第二章 广东省猪场抗菌药物残留检测

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 广东省猪场中喹诺酮耐药基因丰度检测以及与喹诺酮抗菌药物残留的关系

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 小结

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果

5.4 讨论

5.5 小结

第六章 全文讨论与结论

6.1 全文讨论与结论

6.2 本研究创新点

致谢

参考文献

附录 A：发表文章及参加相关学术会议

附录B：攻读博士期间所获奖项