EjTFL1和EjFT调控‘解放钟’枇杷成花时间的功能研究

摘要

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）是蔷薇科枇杷属植物，为中国南方的常绿果树。与大多数春天开花的蔷薇科果树如苹果、梨、桃、李等相反，栽培枇杷是“秋花春实”。苹果、梨等蔷薇科果树的重要开花基因如FT、TFL1等已有报道，然而枇杷开花调控的机制尚不清晰。FT和TFL1是成花调控途径中两个关键基因，FT是开花途径的整合基因，FT整合上游开花信号后与b-ZIP转录因子FD结合，调控下游开花基因AP1、LFY的表达，从而诱导花芽分化；TFL1是花序分生组织特征基因，同FT竞争与FD结合，抑制下游AP1、LFY基因表达，以延长营养生长，抑制开花。本研究主要以栽培枇杷品种解放钟为实验材料，通过石蜡切片观察顶芽花芽分化时期；克隆得到EjFT1、EjFT2、EjTFL1-1、EjTFL1-2、EjFD五个基因和EjTFL1-1、EjTFL1-2基因的启动子，并进行了序列分析。通过qPCR技术分析了这些基因在不同时期和不同组织的表达模式。同时转化拟南芥验证了EjTFL1-1和EjTFL1-2的遗传功能；并转化烟草表皮细胞，分析了EjFT1、EjFT2、EjTFL1-1和EjTFL1-2亚细胞定位；利用BiFC技术验证了EjTFL1-1、EjTFL1-2分别与EjFD之间的相互作用。研究主要结果如下：
　　（1）观察栽培枇杷解放钟和早钟6号的顶芽形态变化，并取样制作石蜡切片对其进行解剖学观察，结果显示解放钟和早钟6号顶芽都在7月开始花芽分化；但二者花序发育进度不同，可能是导致二者开花迟早较大不同，早钟6号更早开花的原因。
　　（2）利用同源基因在枇杷基因组数据库（未公开发表）进行查询，获得了编码EjFT1、EjFT2、EjTFL1-1、EjTFL1-2和EjFD的序列，并从解放钟中分别克隆得到这五个基因。氨基酸序列比对，表明 EjFT1、EjFT2、EjTFL1-1、EjTFL1-2与其他物种的同源基因的同源性很高，尤其是与同属蔷薇科的苹果同源性最高，均达98％及以上，此外重要氨基酸功能位点都保守。系统进化树分析表明EjFT1、EjFT2、EjTFL1-1、EjTFL1-2与苹果的MdFT和MdTFL1同源基因亲缘关系最近，聚在同一个小分枝上。EjFD则有保守的b-ZIP结构域。克隆得到EjTFL1-1、EjTFL1-2基因的启动子，并对其顺式作用元件进行了分析，推测EjTFL1-1和EjTFL1-2的表达可能受多种内外环境因素共同调节。
　　（3）以枇杷不同时期顶芽、叶片和其他组织为材料，并用qPCR技术对基因进行时空表达模式分析。结果显示EjTFL1-1和EjTFL1-2主要是在花芽分化前大量表达，并在随后显著下调。而不同组织中的基因表达结果显示EjTFL1-1和EjTFL1-2主要是在叶芽大量表达；并且EjTFL1-1在茎中有表达，EjTFL1-2则在花和果实也有表达。EjFT1在叶片、叶芽、花芽和果实中均能检测到表达；而EjFT2则在除叶片外的其他组织中都能检测到表达，而且在花和果实中表达较高。这些结果暗示EjTFL1-1和EjTFL1-2抑制解放钟花芽分化，并且提示EjFT1、EjFT2和EjTFL1-2可能还调控解放钟花果发育。
　　（4）将EjTFL1-1、EjTFL1-2基因在拟南芥中过表达，明显推迟拟南芥开花时间，此外植株的分枝数量、花序结构、果荚形状等表型与野生型相比也都有明显差异。对转基因植株的TFL1下游基因AP1和LFY进行定量分析，结果显示AP1和LFY的表达明显下调。这些结果说明，EjTFL1-1和 EjTFL1-2具有与拟南芥TFL1相似的抑制成花和调控花序发育的功能。
　　（5）EjFT1、EjFT2、EjTFL1-1和EjTFL1-2转化烟草表皮细胞，发现EjFT1、EjFT2、EjTFL1-1和EjTFL1-2均分布在细胞核与细胞质中。此外，BiFC实验证明EjTFL1-1、EjTFL1-2分别与EjFD在细胞核内相互作用，与拟南芥的报道相似。

目录

声明

缩略词

1 前言

1.1 植物成花调控分子机理研究进展

1.2 植物FT和TFL1基因家族研究进展

1.3 研究目的及意义

1.4 研究技术路线

2 材料与方法

2.1 植物材料与样品采集

2.2 菌株及试剂

2.3石蜡切片

2.4 RNA提取和cDNA的合成

2.5 EjFT、EjTFL1和EjFD基因以及EjTFL1启动子的克隆及序列分析

2.6基因表达分析（Real time RT-PCR）

2.7 基因表达载体的构建

2.8拟南芥转化及筛选

2.9亚细胞定位及BiFC相互作用观察

3 结果与分析

3.1?解放钟?及?早钟6号?花芽分化时期的观察

3.2?解放钟?FT、TFL1及FD基因的克隆

3.3?解放钟?FT、TFL1基因的表达模式分析

3.4 EjFT、EjTFL1的亚细胞定位观察

3.5 EjTFL1对拟南芥开花时间的影响

3.6 EjTFL1过表达拟南芥的其他表型分析

3.7 EjTFL1与EjFD相互作用

3.8 EjTFL1启动子的克隆与分析

4 讨论与结论

4.1 EjFT、EjTFL1基因的保守性

4.2 EjFT、EjTFL1基因的功能分析

4.3 结论

4.4 本研究的创新之处

4.5 本研究可以开展的下一步工作

致谢

参考文献

附录 EjFT、EjTFL1和EjFD的核苷酸序列和推导氨基酸序列