水稻种子休眠性基因qSD7-1的精细定位和转录组分析

摘要

水稻种子休眠性与穗发芽抗性和种子的安全贮藏密切相关，同时也严重影响着水稻的产量和稻米品质。因此，研究水稻种子休眠性的遗传基础对培育适度休眠性的水稻优良品种、保障种子生产和贮藏安全均具有重要现实意义。本研究通过单片段代换系（W22S）与受体亲本“华粳籼74”（W0）杂交构建F2分离群体，并进一步发展次级单片段代换系，对水稻种子休眠性新基因qSD7-1进行精细定位和候选基因的初步研究，同时进行相关的转录组分析，获得了以下主要研究结果：
　　1、利用供体亲本为Khazar的单片段代换系W22S与受体亲本“华粳籼74”（W0）杂交的F2分离群体中含有目标基因的合适单株自交产生F3群体；采用分子标记辅助选择从中筛选到了8份不同代换片段长度的次级单片段代换系，利用重叠群代换作图的方法将水稻种子休眠性新基因qSD7-1定位于LCB14--LCB15-UI174--LCB5约48.9 kb的范围，该区间存在9个候选基因。
　　2、利用对照W0与单片段代换系W22S材料对目标区间的9个候选基因进行实时荧光定量表达实验，其中ORF1、ORF3、ORF6、ORF8和ORF9在种子发育过程中的整体表达量均较高，且在W0和W22S两个材料的发育后期中，其相对表达量差异均达到极显著水平；同时在发育后期剑叶和枝梗的定量表达实验中，ORF1、ORF3与ORF8的表达量相对较高且差异极显著，而ORF6和ORF9在剑叶与枝梗中表达量很低，因此初步推测ORF1、ORF3、ORF6、ORF8和ORF9为可能的目标候选基因，且不同候选基因在不同组织中的表达模式不一致。
　　3、利用对照W0与单片段代换系W22S材料对目标区间的9个候选基因进行测序，发现除ORF1和ORF6外，其余均未在两个材料间发现序列上的差异。其中与W0相比，来自单片段代换系W22S的ORF1在第1内含子317-318 bp处有两个AT碱基缺失，在第2、8和9外显子上存在单碱基的突变，但均为同义突变，未发生氨基酸变化；ORF6的编码区在W0和W22S存在一个C/T的单碱基突变，会引起氨基酸从精氨酸变为色氨酸，而色氨酸是植物内生长素合成的重要前体物质，同时ORF6含有F-Box蛋白家族，这类蛋白家族成员在植物激素（尤其是GA和ABA）的信号转导和糖代谢等过程中有重要功能，与种子萌发和休眠密切相关，同时对来源不同的单片段代换系进行测序发现ORF6在C/T处的突变与水稻种子休眠性高度相关，即突变位点为T的种子休眠性较强，而突变位点为C的休眠性较弱，因此推测ORF6为目标候选基因。
　　4、利用4份供体来源不同的单片段代换系对qSD7-1进行等位基因变异分析，结果在不同材料间发现3种等位基因类型，其种子休眠性由强到弱分别依次为qSD7-11、qSD7-12、qSD7-13。
　　5、对抽穗30 d的单片段代换系W22S和“华粳籼74”（W0）进行转录组测序，共检测到59个差异基因，其中上调基因14个，下调基因45个；转录组差异基因的注释表明这些差异基因主要参与了亚麻油酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、糖酵解途径等次级代谢物的生物合成过程，推测qSD7-1基因调控种子休眠的方式可能与次级代谢物如糖类、氨基酸等有关。
　　本研究对水稻种子休眠性基因qSD7-1进行了精细定位，并对其候选基因进行了测序和定量表达分析，鉴定出具有不同遗传效应的等位基因，进一步明确了水稻种子休眠性的遗传基础，为水稻种子休眠性基因qSD7-1的克隆及种子休眠性的分子设计育种奠定了基础。

目录

声明

缩写词及其中英文对照

1 文献综述

1.1 水稻种子休眠性QTL的定位

1.2 水稻种子休眠QTL的精细定位和图位克隆

1.3 F-box基因家族在种子发育与萌发过程中的作用

1.4 水稻种子休眠的转录组学研究

1.5物质代谢与种子休眠和萌发的关系

1.6 单片段代换系在分子设计育种上的利用

1.7 本研究目的及意义

2.1 供试材料

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器设备

2.4试验方法

3结果

3.1 qSD7-1的定位

3.2 qSD7-1的候选基因分析

3.3 qSD7-1的遗传效应分析

3.4 qSD7-1的转录组分析

4.1 讨论

4.2 结论

致谢

参考文献

附录A 转录组的测序质量

附录B 59个差异基因

附录C