呕吐毒素抑制猪肠上皮细胞增殖和干细胞扩增的机制研究

摘要

呕吐毒素化学名称是脱氧雪腐镰刀菌烯醇，由镰刀菌属产生，是世界上污染程度最广的霉菌毒素之一。猪是对呕吐毒素最敏感的家畜。肠上皮是呕吐毒素作用的靶器官之一，呕吐毒素通过扰乱肠上皮的更新进程，从而破坏肠上皮结构和功能。肠上皮更新的动力来源于肠道干细胞，因此本研究提出假设，低剂量呕吐毒素短时间处理可抑制猪肠上皮细胞的增殖和猪肠道干细胞的扩增。为验证该假说，从以下五个方面开展研究：
　　试验一：以IPEC-J2细胞（an epithelial cell line derived from newborn piglet jejunum）为试验材料，研究呕吐毒素的剂量和处理时间对猪肠上皮细胞增殖、屏障和目的蛋白表达的影响。500 ng/mL呕吐毒素处理2 h可显著抑制（P＜0.05）IPEC-J2细胞增殖，对单层IPEC-J2细胞的跨膜电阻值和通透性无显著（P＞0.05）影响，下调（P＜0.05）沉默型肠道干细胞标记基因 Bmi1（B cell specific moloney murine leukemia virus insertion site1）、PCNA（proliferating cell nuclear antigen）、β-catenin、c-Myc和cyclin D1的表达水平，上调（P＜0.05）Axin2的表达水平。以上结果提示，低剂量呕吐毒素短时间处理抑制细胞增殖，Wnt/β-catenin信号通路可能参与该过程。
　　试验二：为研究呕吐毒素短时间处理对仔猪小肠上皮形态结构、屏障功能和目的蛋白表达的影响，选择5 d哺乳仔猪，对照组和呕吐毒素组仔猪分别口服0和0.3 mg/kg体重（BW, body weight）的呕吐毒素，2 h后行空肠结扎术评价荧光素钠吸收。与对照组相比，呕吐毒素组血浆中荧光素钠的含量无显著（P＞0.05）变化，空肠隐窝明显肥大。Western blotting结果显示，呕吐毒素组Bmi1、ZO-1、Occludin、mTOR（mammalian target of rapamycin）、S6K1（ribosomal S6 protein kinase1）、phospho(p)-S6K1、eIF4E（eukaryotic initiation factor4E）、β-catenin、c-Myc和cyclin D1的表达水平显著降低（P＜0.05），GSK3β（glycogen synthase kinase3β）显著上调（P＜0.05）。以上结果提示呕吐毒素短时间处理可能对猪肠道干细胞产生不利的影响。
　　试验三：为建立猪肠道干细胞体外培养方法及相关的评价技术，主要包括以下几个实验：（1）首先在显微镜下观察1 d仔猪小肠的隐窝绒毛轴结构，初步制定分离隐窝单位的策略；（2）比较不同日龄仔猪隐窝单位的大小，最终选择5 d仔猪用于后续的研究；（3）通过总结和分析三种不同分离方法的隐窝单位质量和所需时间，对猪小肠隐窝单位的分离方法进行优化，优化后的方法可在较短的时间内获得结构完整、纯度高达95%的隐窝单位；（4）在此基础上建立了猪隐窝单位的体外三维培养体系，还研究证明了在培养中后期加入Cdx2（Caudal type homeobox2）条件性培养基可显著提高（P＜0.05）猪类肠团（enteroid）形成效率和出芽效率；（5）在隐窝单位培养体系的基础上添加Jagged-1，可用于猪隐窝细胞的培养；（6）通过流式细胞术，用Draq7染料和CD24、CD44、CD166抗体，分选获得CD44+CD24lowCD166+的细胞群，在体外三维培养条件下该细胞群可有效地扩增成为类肠团，表明该细胞群富集猪肠道干细胞；（7）建立了慢病毒感染隐窝细胞、MTT测定类肠团扩增能力、类肠团免疫荧光染色等实验方法。首次成功建立了猪肠道干细胞研究的技术体系，为机制研究奠定基础。
　　试验四：为研究呕吐毒素对猪肠道干细胞扩增能力的影响，一方面，选择5d仔猪，口服0（对照组）和0.3 mg/kg BW（呕吐毒素组）呕吐毒素，处理2 h采集对照组和呕吐毒素组小肠隐窝单位，进行体外三维培养；另一方面，采集正常5d仔猪小肠隐窝单位，消化成隐窝细胞，体外三维培养5d后分别添加不同浓度呕吐毒素处理2和24 h。结果表明，在体呕吐毒素处理2 h后显著降低（P＜0.05）猪类肠团形成效率和出芽效率，体外250和500 ng/mL呕吐毒素处理24 h极显著抑制（P＜0.01）猪类肠团的出芽效率；EdU结果显示，500 ng/mL呕吐毒素处理2 h明显抑制类肠团扩增能力，降低 Bmi1的荧光强度，下调（P＜0.05）活跃型肠道干细胞标记基因 Lgr5（leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor5）的蛋白水平。以上结果提示，呕吐毒素在体和体外短时间处理均可抑制猪肠道干细胞的扩增能力。
　　试验五：为了进一步挖掘呕吐毒素短时间处理对猪肠上皮增殖和干细胞扩增的作用机制，选择试验二中对照组和呕吐毒素组仔猪空肠样品各3个，进行iTRAQ蛋白质组学和生物信息学分析。共检测到蛋白总数为5175，差异表达蛋白94个，其中上调蛋白69个、下调蛋白25个。差异蛋白富集的生物进程主要包括细胞通讯、信号传导调节、应激反应、细胞分化、细胞凋亡进程调节和细胞增殖调节，富集的细胞组分主要包括细胞质囊泡、分泌小体、细胞膜以及顶膜。KEGG分析结果显示，富集的信号通路为PI3K（phosphoinositide3-kinase）/Akt信号通路、JAK（Janus kinase）/STAT（signal transducers and activators of transcription）信号通路、细胞内吞作用和ABC（ATP-binding cassette）转运载体。
　　以上结果说明，呕吐毒素短时间处理不影响猪肠道屏障功能，但显著抑制猪肠上皮细胞增殖和肠道干细胞扩增。其作用机制与ABC transporter、PI3K/Akt/mTOR信号通路、JAK/STAT信号通路和Wnt/β-catenin信号通路有关。研究成果为揭示呕吐毒素损伤猪肠上皮更新的机制以及猪肠道干细胞的相关研究奠定基础。

目录

声明

英文缩写词表

1.1 研究背景

1.2 主要研究内容

2.1 引言

2.2 技术路线

2.3 材料与方法

2.4 结果与分析

2.5 小结

3.1 引言

3.2 技术路线

3.3 材料与方法

3.4 结果与分析

3.5 小结

4.1 引言

4.2 技术路线

4.3 材料与方法

4.4 结果与分析

4.5 小结

5.1 引言

5.2 技术路线

5.3 材料与方法

5.4 结果与分析

5.5 小结

6.1 引言

6.2 技术路线

6.3 材料与方法

6.4 结果与分析

6.5 小结

7.1 全文讨论

7.2 全文结论

7.3 创新点

7.4 研究展望

致谢

参考文献

附录A 过表达Cdx2细胞株的鉴定

附录B 荧光素钠标准曲线

附录C 攻读博士学位期间的学术成果