三种饲料添加剂对仔猪肠道屏障功能的作用及机理研究

摘要

研究开发安全、环保、高效的新型饲料添加剂以代替传统饲用抗生素是当今动物营养研究领域的热点之一。本文以鸭AvB D2、枯草芽孢杆菌、乳铁蛋白为研究对象，通过离体细胞实验，研究鸭AV BD2、枯草芽孢杆菌、乳铁蛋白对断奶仔猪肠道上皮通透性、紧密连接完整性和紧密连接相关基因表达量的影响，从分子水平上揭示鸭AV BD2、枯草芽孢杆菌、乳铁蛋白对断奶仔猪肠道上皮机械屏障的保护作用及机理。
　　鸭AvBD2、枯草芽孢杆菌和乳铁蛋白对IPEC-J2及毒性作用的实验结果表明，鸭AvBD2-A/B对IPEC-J2的LDH释放率有较明显的促进作用，浓度分别为3.125μg/mL和6.25μg/mL时LDH释放率最小，其释放率分别为4.76%和4.22%；鸭AvBD2-C的对IPEC-J2的LDH释放率没有明显的促进作用，浓度为6.25μg/mL时，LDH释放率为13.61%，此时LDH释放率最小。枯草芽孢杆菌和乳铁蛋白对IPEC-J2的LDH释放率也有明显的促进作用，在浓度分别为200μg/mL和300μg/mL时LDH释放率最小，释放率分别为9.35%和12.23%。
　　猪空肠上皮细胞系IPEC-J2细胞连续培养21天后，上皮细胞跨膜电阻在18天以后达到3500?左右，然后趋于稳定，表明IPEC-J2细胞已分化结束。细胞通透性结果表明，6 h里Tra ns we ll底部培养基里的FD4的渗透率维持在2.15%左右，表明上皮细胞的通透性较小。LPS刺激下，6h里FD4的渗透率达到了22%左右，预先经过鸭AvBD2、枯草芽孢杆菌与乳铁蛋白处理的实验组，6 h里FD4的渗透率都在8%以下，说明鸭 AvBD2、枯草芽孢杆菌与乳铁蛋白可以有效的减缓 LPS对上皮细胞通透性的加大。同样使用LPS刺激，短时间内电阻值急剧下降，LPS组的电阻值更是下降到了53%，随后电阻有所上升，但最后电阻继续下降。而预先用鸭AvBD2、枯草芽孢杆菌与乳铁蛋白处理的实验组，每个时刻的电阻值都高于LPS组，说明鸭AvBD2、枯草芽孢杆菌与乳铁蛋白可以缓解LPS对IP EC-J2屏障完整性的破坏作用。
　　培养至21天的IPEC-J2细胞，通过透射电镜观察，可以清楚地看到细胞间已经形成致密的紧密连接，鸭AvBD2、枯草芽孢杆菌和乳铁蛋白对细胞间的紧密连接没有破坏作用。LPS可以破坏IPEC-J2的紧密连接结构，鸭AvBD2、枯草芽孢杆菌与乳铁蛋白在LPS刺激下对IPEC-J2紧密连接结构的破坏作用中起到了保护或者缓解的作用。
　　荧光定量检测紧密连接蛋白基因表达水平的实验结果表明，鸭AvBD2、枯草芽孢杆菌与乳铁蛋白对紧密连接蛋白与黏蛋白相关基因的表达量呈现了一定的时间效应，处理时间长短的不同，基因的表达量也不同。鸭AvBD2-A处理12 h，目标基因ZO1转录水平提高；鸭AvBD2-A处理24 h，目标基因ZO2、Claudin1、MUC1、MUC4和MUC20的转录水平提高；鸭AvBD2-A处理48 h，目标基因ZO1、ZO2、MUC1、MUC4和MUC20的转录水平提高；差异性显著。鸭AvBD2-B处理12 h，目标基因ZO1的转录水平提高；鸭AvBD2-B处理24 h，目标基因Claudin1的转录水平提高；差异性显著。鸭AvBD2-C处理24 h后，目标基因MUC4的转录水平提高；差异性显著。枯草芽孢杆菌处理12 h和24 h，目标基因ZO1、ZO2、Claudin1、MUC1、MUC4和MUC20的转录水平提高；草芽孢杆菌处理24 h和48 h，目标基因Occludin的转录水平提高；差异性显著。乳铁蛋白处理24 h，目标基因Claudin1、MUC4和MUC20的转录水平提高；差异性显著。除以上之外，目标基因的转录水平差异性不显著。
　　鸭AvBD2、枯草芽孢杆菌与乳铁蛋白对信号转导通路MEK1/2、p38、PKC和PI3K的研究实验结果表明。MEK1/2信号转导通路，加入抑制剂U0126后，所有目标基因的表达量下降，差异性显著。相较于抑制剂组，鸭AvBD2-A处理后，目标基因Occludin、MUC4和MUC20的表达量提高，差异性显著；鸭AvBD2-B处理后，目标基因ZO1、ZO2、Claudin1的表达量提高，基因MUC20表达量下降，差异性显著；鸭AvBD2-C处理后，目标基因ZO1、ZO2和Occludin的表达量提高，差异性显著；枯草芽孢杆菌处理后，目标基因ZO1、ZO2、Claudin1、Occludin、MUC1和MUC4的表达量提高，差异性显著；乳铁蛋白处理后，目标基因MUC1、MUC4和MUC20的表达量提高，差异性显著。p38信号转导通路，加入抑制剂SB203580后，所有目标基因的表达量下降，差异性显著；相较于抑制剂组，鸭AvBD2-A处理后，目标基因Claudin1、Occludin和MUC1的表达量提高，差异性显著；鸭AvBD2-B处理后，目标基因ZO1、ZO2、Claudin1和Occludin表达量提高，差异性显著；鸭AvBD2-C处理后，目标基因ZO2、Claudin1、Occludin、MUC1和MUC4表达量分别提高，基因MUC20的表达量下降，差异性显著；枯草芽孢杆菌处理后，目标基因ZO1、ZO2、Claudin1、Occludin、MUC1和MUC20的表达量提高了，差异性显著；乳铁蛋白处理后，目标基因MUC20的表达量提高，差异性显著。PKC信号转导通路，加入抑制剂Staurosporine后，目标基因ZO1、ZO2、Claudin1、Occludin、MUC1和MUC20的表达量下降，差异性显著；相较于抑制剂组，鸭AvB D2-A处理后，所有目标基因的表达量提高，差异性显著；鸭AvBD2-B处理后，目标基因ZO1、ZO2、Occludin、MUC1和MUC4表达量提高，基因MUC20的表达量下降了，差异性显著；鸭AvBD2-C处理后，目标基因ZO1、ZO2、Occludin、MUC1和MUC4表达量提高，基因MUC20的表达量下降，差异性显著；枯草芽孢杆菌处理后，目标基因ZO1、ZO2、Occludin、MUC1和MUC4的表达量提高，基因MUC20的表达量下降，差异性显著；乳铁蛋白处理后，目标基因Occludin、MUC1和MUC4的表达量提高，基因ZO2的表达量下降，差异性显著。PI3K信号转导通路，加入抑制剂Wortmannin后，目标基因 ZO1、ZO2、Claudin1、Occludin和MUC1的表达量下降，基因MUC20的表达量提高，差异性显著；相较于抑制剂组，鸭AvBD2-A处理后，目标基因Occludin、MUC1、MUC4和MUC20的表达量提高，差异性显著；鸭AvBD2-B处理后，目标基因ZO1、ZO2、Claudin1、MUC1和MUC4的表达量提高；基因MUC20的表达量下降，差异性显著；鸭AvBD2-C处理后，目标基因ZO1、MUC1、MUC4的表达量提高；差异性显著；枯草芽孢杆菌处理后，目标基因标基因ZO1、ZO2、MUC1、MUC4和MUC20的表达量提高，差异性显著；乳铁蛋白处理后，目标基因MUC1、MUC4的表达量提高，基因ZO1、ZO2的表达量下降，差异性显著。综上，鸭AvBD2-A和枯草芽孢杆菌可以通过MEK1/2和p38信号通路、PKC信号通路和PI3K信号通路来提高目标基因的表达量；鸭AvBD2-B可以通过p38信号通路来提高目标基因的表达量；鸭AvBD2-C可以通过MEK1/2信号通路、PI3K信号通路来提高目标基因的表达量；乳铁蛋白可以通过 MEK1/2和 p38信号通路来提高目标基因的表达量，保护肠道屏障，维持肠道环境的稳定。

目录

声明

英文缩略词

1. 1概况

1. 2肠道上皮机械屏障的概述

1. 3 抗菌肽、芽孢杆菌和乳铁蛋白对肠道上皮屏障的影响

1.4鸭β-防御素-2（Avianβ-defensin-2，AvBD2）

1.5枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，B.subtilis）

1.6乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）

1. 7本研究的目的和意义

2. 1引言

2. 2材料与方法

2. 3试验方法

2. 4试验结果

2. 5 讨论

2. 6结论

3. 1引言

3. 2材料与方法

3. 3试验方法

3. 4试验结果

3. 5讨论

3. 6结论

4. 1引言

4. 2材料与方法

4. 3试验方法

4. 4试验结果

4. 5讨论

4. 6结论

5. 1引言

5. 2材料与方法

5. 3试验方法

5. 4试验结果

5. 5讨论

5. 6结论

6. 1引言

6. 2材料与方法

6. 3试验方法

6. 4试验结果

6. 5讨论

6. 6 结论

全文总结

致谢

参考文献