鸡烟曲霉菌的分离及定量PCR检测方法的建立

摘要

曲霉菌病是人兽共患传染病，世界各国广泛流行。不仅对禽类造成感染，降低饲养效率;还会感染人，侵害多种器官。因此对鸡场进行真菌病调查;快速、准确的鉴定鸡烟曲霉菌，并建立特异、敏感、快速的诊断方法，对养鸡产业以及人类公共卫生都具有重要意义。
　　经一年四季，采集鸡血清（共287份），用ELISA方法检测(1，3)-β-D葡聚糖（G试验）和半乳甘露聚糖（GM试验）。G试验结果显示血清阳性率呈季节性变化，以夏季最高(28.6％)，其次为秋季(12.8％)、冬季(12.7％)、春季(12.0％)。GM试验结果与之相似。表明鸡真菌病呈季节性变化，夏季为主要流行季节。
　　从河北省20个养鸡场分离疑似鸡烟曲霉菌7株。观察其形态，并提取分离株DNA，利用rDNA-ITS基因通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，测序后序列与GenBank核酸数据库进行BLAST比对。结果显示，分离株呈绒毛状、辐射状生长，菌落中央为墨绿色，周边为白色。显微镜下菌丝呈棉花样，孢子梗顶端分散着球形分生孢子，成绿色或深绿色。分离株与GenBank鸡烟曲霉菌的同源性在99.8％以上，与同属菌同源性在69.4％-85.4％之间。形态学观察结合rDNA-ITS基因序列分析，将7株分离株鉴定为鸡烟曲霉菌。
　　利用细胞表面蛋白基因（cell surface protein CSP基因）对鸡烟曲霉菌进行分型。结果共分为4种基因型:t04A型（1株）、t09c型（3株）、t18b型（1株）和t22b型（2株）。
　　选用分离株（t09c型）对5日龄雏鸡喉头滴注1.9×109CFU/mL菌悬液100μL。分别采集2份病料，用作菌培养、制备病理切片，切片行HE、PAS、GMS、CFW染色。结果雏鸡接种后3d出现呼吸困难等症状，解剖发现气囊增厚，肺充血有黄色斑点;病料中分离鉴定出烟曲霉菌;显微镜下，肺充血，组织结构消失，特殊染色病灶内有大量菌丝。这些提示成功建立烟曲霉感染鸡模型。
　　根据Genbank已发表的benAfum基因序列设计一对特异性引物，在此基础上建立检测鸡烟曲霉菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，并用该方法对鸡烟曲霉菌分离株进行检测。结果显示，该方法灵敏度高，对鸡烟曲霉菌最低检出量为3.76×101CFU/mL;重复性好，变异系数在0.7％-0.8％;特异性强，与黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、塔宾曲霉、白色念珠菌等病原菌无交叉反应;该方法操作简单，耗时短，整个试验过程只需2h。提示该方法可应用于鸡烟曲霉菌感染的快速检测。
　　针对鸡白色念珠菌rDNA基因和鸡烟曲霉benAfum基因保守序列，设计两对特异性引物，建立了检测鸡烟曲霉菌和鸡白色念珠菌SYBR GreenⅠ荧光双重定量PCR方法。结果显示在熔解温度84.5℃-85.0℃和82.0℃-82.5℃分别出现鸡白色念珠菌和鸡烟曲霉菌特异波峰，且与其他真菌没有交叉反应;鸡白色念珠菌和鸡烟曲霉重复试验变异系数分别为0％、0.2％;最低检测浓度分别为4.34×101CFU/mL、3.76×101CFU/mL。这提示该建立双重SYBR GreenⅠ定量PCR方法，特异、稳定、敏感，可用于鸡烟曲霉菌和鸡白色念珠菌的检测。
　　将检测鸡白色念珠菌和鸡烟曲霉菌双重定量PCR的试剂组装成试剂盒，用分离株和病料样品，对其特异性、敏感性、重复性进行检测。结果均良好。

目录

声明

摘要

第一章 鸡烟曲霉菌的研究进展

1．1 鸡烟曲霉菌病的概述

1．2 曲霉菌病流行病学调查

1．3 烟曲霉菌的检测方法

1．3．1 分离培养方法

1．3．2 直接涂片方法

1．3．3 病理组织学方法

1．3．4 血清学方法

1．3．5 DNA指纹分析为基础的方法

1．3．6 分子杂交技术

1．3．7 以测序为基础的方法

1．3．8 以PCR技术为基础的方法

1．4 目的及意义

第二章 鸡真菌病的流行病学调查

2．1 材料和方法

2．1．1 材料

3．2．2 分型结果

3．2．3 攻毒试验

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 鸡烟曲霉SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的建立

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果

4．2．1 标准曲线的建立

4．2．2 特异性检测

4．2．3 敏感性检测

4．2．4 重复性检测

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 鸡烟曲霉菌和白色念珠菌SYBR Green Ⅰ双重荧光定量PCR方法的建立

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．2 结果与分析

5．2．1 标准品的构建及标准曲线的绘制

5．2．2 双重荧光定量PCR反应的特异性检测

5．2．3 双重荧光定量PCR反应的敏感度检测

5．2．4 双重荧光定量PCR反应的重复性检验

5．3 讨论

5．4 小结

6．1 材料

6．2 方法

6．2．1 试剂盒的组装

6．2．2 试剂盒检测参数的评价

6．2．3 试剂盒的应用

6．2．4 试剂盒的保存条件与保存期的确定

6．3 结果

6．3．1 敏感性试验及标准曲线的建立

6．3．2 特异性试验

6．3．3 重复性试验

6．3．4 试剂盒的应用

6．3．5 试剂盒的保存条件与保质期

6．4 讨论

6．5 小结

结论

创新点

致谢

参考文献

作者简介

攻读硕士学位期间发表的论文

参加科研情况