单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达

摘要

单纯疱疹病毒2型(herpessimplexvirustype2，HSV-2)糖蛋白D(glycoproteinD，gD)是HSV-2US6基因的转录翻译产物，与病毒吸附、膜融合有关，介导病毒胞间扩散，其抗体有中和作用。gD2是HSV糖蛋白中免疫原性较强的糖蛋白，具有在HSV-2和HSV-1之间具有较高同源性的特征，能在体内引起高滴度的中和抗体。HSV-2gD是抗HSV感染中最重要的保护性抗原，它能诱导细胞免疫和体液免疫反应，保护动物免受HSV的攻击，抑制隐性感染的发生。HSV-2gD的高效表达和纯化为深入研究其生物学功能和免疫学特性有积极的意义，同时对于其亚单位疫苗和抗体的制备奠定基础。 该项研究主要内容包括HSV-2gD的扩增获得，毕赤酵母表达载体的构建和在毕赤酵母中的表达的研究。 在研究中，分析GENEBANK中的不同HSV-2gD基因序列，PCR扩增去除信号肽的HSV-2gD全长序列；并且将序列TA克隆到pMD18T线形载体中，获得重组pMD18T-gD2质粒；质粒经过序列测定分析，与GENEBANK中的NC_001798的HSV-2gD碱基序列同源性为99.4％，蛋白序列同源性为97.3％。 设计五条引物，加入XhoⅠ和XbaⅠ两个酶切位点，同时引入HSV-2gBCTL表位序列基因和终止密码子；以pMD18T-gD2质粒为模板PCR扩增得到四个含有不同的末端的PCR产物，PCR产物经过XhoⅠ和XbaⅠ双酶切后和PICZαA空载体连接后得到四个HSV-2gD毕赤酵母表达载体；载体采用通用引物测序分析，载体的分泌肽序列和设计的5'末端正确地接合，载体中的HSV-2gD碱基序列与GENEBANK中的NC_001798的HSV-2gD碱基序列同源性为99.3％，变化的部分没有影响到碱基中的基序(motif)，蛋白序列同源性为97.3％，变化的部分没有在蛋白的主要的功能区中。 将四个载体经SacⅠ线形化后，电转化后转入到毕赤酵母GS115中，筛选转化子后，采用PCR的方法鉴定四个质粒中目的序列都已经整合到GS115的基因组中，同时得到转化子的表型都为Mut+。 甲醇诱导重组转化得到的工程菌，收集发酵液上清。发酵液上清经SDS-PAGE检测发现在蛋白分子量43KDa附近有两条明显条带，与预计的蛋白分子量相近，初步认为是毕赤酵母表达的重组HSV-2gD蛋白；经过浓缩后，采用Dot-Blotting分析蛋白具有活性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

华南理工大学学位论文原创性声明和版权使用授权书

第一章绪论

1.1单纯疱疹病毒Ⅱ型感染及其治疗

1.1.1单纯疱疹病毒Ⅱ型

1.1.2 HSV-2感染

1.1.3 HSV-2感染的治疗及其存在的问题

1.1.4疫苗－预防和治疗GH的最有前途的途径

1.2单纯疱疹病毒2型糖蛋白D的研究

1.3细胞毒性T淋巴细胞(CTL)与HSV-2 GD

1.3.1细胞毒性T淋巴细胞

1.3.2 CTL与HSV-2 gD

1.4亚单位蛋白疫苗

1.5毕赤酵母表达系统的研究

1.5.1毕赤酵母表达系统的优点

1.5.2毕赤酵母表达系统的构成

1.5.3巴斯德毕赤酵母的转化

1.5.4外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达优化

1.5.5分泌蛋白的糖基化特征

1.6本课题的意义和主要内容

第二章单纯疱疹病毒2型糖蛋白D全序列的分子克隆

2.1引言

2.2试验材料与设备

2.2.1主要仪器和设备

2.2.2质粒与菌株

2.2.3主要试剂

2.2.4溶液与培养基

2.3技术路线

2.4实验方法

2.4.1 PCR引物设计

2.4.2 HSV-2基因组DNA提取

2.4.3全长HSV-2 gD的PCR扩增

2.4.4琼脂糖凝胶电泳

2.4.5 PCR产物凝胶回收纯化

2.4.6 PCR产物与T载体的连接

2.4.7大肠杆菌感受态的制备

2.4.8连接产物的转化

2.4.9重组转化子的筛选

2.4.10重组质粒的提取与鉴定

2.4.11重组质粒中目的基因序列的测定

2.4.12重组质粒中目的基因序列的比对

2.5试验结果

2.5.1 HSV-2 gD的PCR克隆

2.5.2重组质粒的双酶切鉴定

2.5.3重组质粒的基因序列测定

2.6讨论

第三章单纯疱疹2型糖蛋白D毕赤酵母表达载体构建

3.1前言

3.2实验材料

3.2.1主要仪器设备

3.2.2质粒和菌株

3.2.3主要试剂

3.2.4溶液和培养基

3.3技术路线

3.4实验方法

3.4.1 HSV-2 gD基因的PCR扩增

3.4.2 HSV-2 gD毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

3.5结果与讨论

3.5.1 PCR扩增不同的HSV-2 gD序列

3.5.2重组表达载体pPICZαA-gD2的电泳鉴定

3.5.3 HSV-2 gD基因编码序列的测序

3.6小结

第四章单纯疱疹病毒2型糖蛋白D毕赤酵母工程细胞的构建及表达鉴定

4.1前言

4.2实验材料

4.2.1主要仪器设备

4.2.2质粒和菌株

4.2.3主要试剂

4.2.4溶液和培养基

4.3实验方法

4.3.1重组质粒电转化毕赤酵母GS115

4.3.2转化子表型的PCR鉴定

4.3.3重组HSV-2 gD在毕赤酵母中诱导表达

4.3.4蛋白的浓缩

4.3.5 SDS-PAGE

4.3.6蛋白印迹(Western Blotting)

4.3.7 Dot-Blotting分析

4.4结果与讨论

4.4.1 HSV-2毕赤酵母工程细胞的构建

4.4.2载体质粒的线性化

4.4.3转化子的PCR鉴定

4.4.4 SDS-PAGE分析

4.4.5重组HSV-2的Dot-blotting鉴定

4.5小结

结论与展望

参考文献

在学期间发表与学位论文内容相关的学术论文

致谢