人尿道鳞癌细胞cDNA文库的构建及单抗性质的研究

摘要

20世纪90年代以来，多种人类肿瘤抗原基因克隆的成功，大大推动了肿瘤免疫学理论的发展，也促进了肿瘤免疫诊断和免疫治疗的应用。由于肿瘤抗原在肿瘤诊断与治疗中具有重要的靶向作用，因此寻找特异性强、基因功能明确的靶分子成为肿瘤分子生物学的研究热点。 原发性尿道癌是一种比较少见的疾病，而男性尿道(阴茎)癌更为罕见，仅占泌尿生殖系统肿瘤的不到1％。尿道(阴茎)鳞状细胞癌是男性尿道(阴茎)癌中所占比例相对比较大的一种，约占其69％-90％。尿道(阴茎)鳞状细胞癌的治疗主要限于放疗和切除等几种方式，其效果也不是很理想。目前随着尿道(阴茎)鳞状细胞癌发病率升高的形式和预后不佳的状况迫切需要寻找一种新的有效的治疗手段，对新的肿瘤相关抗原进行鉴定，利用该抗体进行患者组织标本的免疫学检测，可以有助于肿瘤的病理学诊断和鉴别诊断。该项研究针对以实验室制备的多株人尿道鳞癌单克隆抗体进行免疫学性质的研究，并构建了人尿道鳞癌HUS-98细胞cDNA表达文库，为进一步利用单抗对cDNA文库进行免疫学筛选提供了前期准备。实验结果如下： 1.尿道鳞癌单抗效价的测定及IgG亚类的鉴定利用ELISA方法测定抗体的效价，用琼脂双向扩散鉴定其IgG亚类。测定的六种单克隆抗体(A6、C8、H11、E6、H6、C4)的效价分别为1：4000，1：8000，1：8000，1：32000，1.1000，1：2000，其中E6的效价可以达到106。其IgG亚类分别为IgG3，IgG1，IgG3，IgG1，IgG1，IgG3。 2.抗人尿道高分化鳞癌单抗(E6、F9)在上皮性肿瘤组织的免疫组化研究利用免疫组织化学链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶(SP)法检测3例正常人组织，48例肿瘤患者组织，其中包括乳腺、胃、结肠、肺腺癌各六例，阴茎、口腔、宫颈鳞癌各六例。正常组织呈阴性染色，肿瘤组织呈现细胞膜和细胞浆阳性着色，E6阳性表达率在鳞癌中为91％(22/24)，腺癌中为88％(16/18)，在肿瘤组织中综合表达率为89％(43/48)，F9阳性表达率在鳞癌中为91％(22/24)，腺癌中为83％(15/18)，在肿瘤组织中综合表达率为87％(42/48)。 3.人尿道鳞癌单克隆抗体对应抗原蛋白免疫印迹分析从乳腺癌组织中提出抗原蛋白质，运用抗原对应抗体进行免疫印迹实验，并以正常小鼠血清为蛋白标准。结果中作为蛋白标准的小鼠正常血清仅出现两条条带，其中一条为重链，分子量为54kD，另外一条为轻链，分子量为27kD。蛋白样品仅出现一条条带，无非特异性条带，通过计算其分子量为46.414kD。 4.人尿道(阴茎)鳞癌上皮细胞(HUS-98)cDNA文库的构建及鉴定用SMART技术，构建了人尿道(阴茎)鳞癌上皮细胞cDNA文库，从人尿道(阴茎)鳞癌上皮细胞中分离总RNA并纯化mRNA，利用经修饰的oligo(dT)引物合成cDNA第一链，利用SMART核苷酸作为cDNA第一链在mRNA5’端延伸出去的模板，采用LD-PCR合成双链cDNA，双链cDNA经酶切和过柱分级分离后，克隆入λTriplEx2载体后经体外包装而成cDNA文库。原始人尿道(阴茎)鳞癌上皮cDNA文库获得1.57×107个重组子，重组率达到98％。文库扩增后，滴度达到4.0×109pfu/ml，插入cDNA平均长度为2.5kb。

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第一章绪论

1.1引言

1.2肿瘤免疫治疗

1.3肿瘤标志物的研究

1.4单克隆抗体

1.4.1 McAb的靶向载体作用

1.4.2 McAb在肿瘤相关抗原筛选中的应用

1.5 cDNA表达文库

1.5.1全长cDNA文库的研究

1.5.2 SMART技术的应用

1.6肿瘤抗原的筛选

1.6.1免疫筛选法

1.6.2杂交筛选法

1.6.3 PCR扩增筛选法

1.6.4 SEREX法

1.7本课题的研究意义

1.8本课题研究的主要内容

第二章 抗人尿道高分化鳞癌单抗效价以IgG亚类的鉴定

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果

2.2.1间接ELISA方法筛选阳性克隆

2.2.2抗体IgG亚类鉴定

2.3 讨论

第三章抗人尿道鳞癌单抗(E6、F9)免疫组化研究

3.1材料与方法

3.1.1材料与主要仪器

3.1.2实验方法

3.2结果

3.2.1 HE染色结果

3.2.2免疫组织化学结果

3.2.3结果分析

3.3讨论

第四章人尿道鳞癌单抗对应抗原蛋白免疫印迹分析

4.1材料和方法

4.1.1 材料与主要仪器设备

4.1.2实验方法

4.2实验结果

4.2.1对应抗原蛋白质的提取

4.2.2蛋白质电泳(SDS-PAGE)

4.2.3免疫印迹(Western-blot)

4.3讨论

第五章 人尿道鳞癌HUS-98细胞cDNA文库的构建

5.1材料与方法

5.1.1材料与主要仪器设备

5.1.2实验方法

5.2实验结果

5.2.1人尿道鳞癌HUS-98细胞总RNA的抽提

5.2.2mRNA的分离纯化

5.2.3双链cDNA的合成

5.2.4 cDNA的克隆及文库构建

5.2.5原始文库的扩增及鉴定

5.3讨论

5.3.1 RNA、mRNA的提取

5.3.2引物的选择及SMART技术的优越性

第六章结论与展望

6.1结论

6.2展望

参考文献

攻读学位期间发表的与学位论文内容相关的学术论文

致谢