鲎素抗菌活性和机理的研究以及鲎素串联基因在枯草杆菌WB800中高效表达

摘要

鲎素(tachyplesin)是从鲎血细胞小颗粒分离提取的一类抗菌肽,具有抗细菌、抗真菌、抗病毒及抑制肿瘤细胞增殖和诱导癌细胞分化的生物活性,是一类具有巨大潜在应用价值的抗菌肽。本论文研究鲎素的抗菌活性、抗菌机理；设计鲎素串联基因在枯草杆菌中的高效表达以及鲎素对小鼠肠道微生物区系的影响。 鲎素在体外的生物活性和分子结构稳定性的研究：采用不同温度、pH值、金属离子、体外蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶B)分别处理鲎素,通过检测鲎素最小抑菌浓度(MIC)的变化,来衡量鲎素生物活性稳定性；采用高效液相色谱(HPLC)法检测鲎素残留量；通过HPLC图谱变化来评定鲎素分子结构稳定性情况。结果表明：在温度小于120℃、pH小于11.30作用情况下,鲎素对大肠杆菌K88的MIC为2.5～10.0 mg/L,高效液相色谱检测鲎素残留质量在65.46～70.21μg之间；鲎素对胃蛋白酶的作用表现出很高的稳定性,对胰蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶的作用稍微敏感,在胃蛋白酶浓度小于320 U/mL,胰蛋白酶浓度小于40 U/mL,羧肽酶B浓度小于20U/mL,弹性蛋白酶浓度小于2.5 U/mL作用下鲎素仍具有活性。这说明鲎素抗菌肽具有较强的高温耐受性,在酸性条件下具有稳定性,同时鲎素具有一定的耐受蛋白酶降解的能力。 鲎素抗菌作用机理探讨：首先确定鲎素的抗菌活力与作用时间的关系；然后采用邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)实验、钼酸铵比色法和紫外吸收法分别检测细菌细胞内膜破坏情况、细菌与鲎素共同孵育前后无机磷和胞内大分子泄漏情况；采用扫描电镜和透射电镜观察细菌和鲎素共同孵育前后细菌形态和结构的变化；采用紫外吸收法和凝胶电泳技术分别观察鲎素对细菌基因组DNA和质粒DNA的结构的影响；采用质粒转化实验检测鲎素对质粒DNA复制和转录功能的影响。结果表明：鲎素对革兰氏阳性菌和阴性菌表现出不同的抗菌活力曲线；经鲎素处理的细菌,细胞内膜遭到破坏,胞内无机磷和生物大分子泄漏显著；鲎素可与细菌基因组DNA和质粒DNA结合,高浓度鲎素可能使DNA发生断裂,进而使质粒DNA复制和转录功能受到抑制。这些表明鲎素的抗菌靶点至少包括细胞壁膜和菌体DNA。 为了实现基因工程高效制备具有稳定结构的鲎素抗菌肽,本研究设计鲎素基因串联表达的方法。采用枯草杆菌表达系统,高拷贝穿梭表达载体pSBPTQ为表达载体,通过RT-PCR扩增鲎素基因和设计合成单链鲎素串联基因,采用直接退火的方法合成鲎素串联基因。重组表达载体转化到枯草杆菌WB800实现高效表达。经(Amp+kan)双抗平板筛选得到重组菌株,2％蔗糖诱导表达串联鲎素产物。采用SDS-PAGE电泳分析表达产物,观察发酵液上清对大肠杆菌E.coli K88和金黄色葡萄球菌S.aureus的抑菌圈。实验结果表明：鲎素基因和串联基因在枯草杆菌中表达成功,重组鲎素TAC和2TAC蛋白表达量分别约为18.2％、36.5％,表达产物在发酵上清液中的含量约为8.25、17.36mg/L;重组鲎素TAC和2TAC对大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌都具有明显的抑菌作用,2TAC经BrCN水解产物抑菌活力高于TAC,而2TAC的表达产量大约是TAC的2倍。这表明通过鲎素串联表达产物降低了自身对宿主的毒性,可以提高鲎素的表达产量。 合成鲎素和基因制备的鲎素对小鼠肠道微生物区系的影响：将健康21日龄清洁级KM小鼠,随机分为4个处理,每个处理3只,每天中午12:00分别灌胃,1)生理盐水(对照组);2)合成鲎素；3)氯霉素；4)鲎素工程菌株发酵液,每次灌胃量各0.5mL,实验共21天。应用PCR和DGGE技术分析了灌胃鲎素对小鼠粪样细菌区系变化的影响。粪样细菌16S rDNA的V6-V8可变区经PCR扩增,扩增产物经DGGE电泳后再进行相似性分析。切下9条DGGE胶中特异性条带,PCR扩增,TA克隆,测序,鉴定细菌种属。实验结果表明,对照组,DGGE电泳条带较多,在不同时期肠道菌群相似性均较高,相似性在73.5％～76.7％之间；灌胃合成鲎素和鲎素工程菌株发酵液组,DGGE电泳条带数和对照组比略有减少,不同处理时期肠道菌群相似性在68.1％～69.4％之间；灌胃氯霉素组,DGGE电泳条带数明显减少,不同处理时期肠道菌群相似性在51.4％～63.0％之间；这一结果表明断奶小鼠在灌胃鲎素和抗生素后,肠道微生物区系和对照比发生了改变,最终形成特定的微生物区系；DGGE中特异条带的鉴定表明,灌胃鲎素可以促进粪链球菌和乳酸杆菌的生长,提高数量。

目录

文摘

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第一章绪论

1.1抗菌肽的分类

1.1.1按照抗菌肽的来源分类

1.1.2按照抗菌肽合成途径分类

1.1.3按照抗菌肽表面电荷性质分类

1.1.4按照抗菌肽的结构分类

1.2抗菌肽的性质

1.2.1抗菌肽的理化性质

1.2.2抗菌肽的作用特点

1.3抗菌肽的抗菌机理

1.3.1对细胞膜靶点的作用机制

1.3.2免疫调节作用

1.3.3诱导肿瘤细胞凋亡

1.3.4抑制细菌的呼吸及对线粒体攻击作用

1.3.5对细胞核染色体的影响

1.3.6对癌细胞骨架的断裂作用

1.3.7抑制蛋白质及细胞壁合成

1.3.8抑制酶的活性

1.4抗菌肽基因工程研究进展

1.4.1大肠杆菌表达系统

1.4.2枯草芽孢杆菌表达系统

1.4.3在酵母中表达

1.4.4抗菌肽基因工程改良动植物

1.4.5抗菌肽基因改造存在的问题

1.5抗菌肽的开发应用前景及存在的问题

1.5.1抗菌肽的开发应用

1.5.2抗菌肽应用存在的问题

1.5.3抗菌肽的研究开发的方向

1.6本论文的立题依据和研究内容

第二章鲎素抗菌肽体外稳定性及活性的研究

2.1材料与方法

2.1.1主要仪器设备

2.1.2合成鲎素

2.1.3试验菌株

2.1.4主要试剂

2.1.5培养基

2.1.6常用溶液配制

2.1.7稀释法抗菌试验检测鲎素MIC和抑菌圈

2.1.8鲎素溶血活性的测定

2.1.9鲎素体外稳定性研究

2.1.10反相高效液相色谱法评定鲎素一级结构稳定性研究

2.2结果

2.2.1鲎素最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的确定

2.2.2鲎素抗菌肽抗菌活性实验结果

2.2.3鲎素溶血活性检测

2.2.4温度对鲎素生物活性的影响

2.2.5 pH对鲎素生物活性的影响

2.2.6阳离子浓度对鲎素生物活性的影响

2.2.7体外蛋白酶对鲎素生物活性的影响

2.2.8HPLC工作曲线

2.2.9 HPLC检测鲎素的残留量

2.2.10温度对鲎素一级结构稳定性的影响

2.2.11 pH对鲎素一级结构稳定性的影响

2.2.12体外蛋白酶对鲎素一级结构稳定性的影响

2.3讨论

2.3.1鲎素抗菌谱研究

2.3.2鲎素抗菌肽稳定性研究

2.3.3鲎素一级结构稳定性研究

2.4本章小结

第三章鲎素抗菌肽抗菌机理的研究

3.1材料与方法

3.1.1主要仪器设备

3.1.2试剂盒和生化试剂

3.1.3试验菌株

3.1.4培养基

3.1.5鲎素抗菌活力与作用时间之间关系

3.1.6鲎素对大肠杆菌F41和金黄色葡萄球菌S.aureus作用的电镜观察

3.1.7鲎素对细菌细胞膜通透性影响

3.1.8鲎素对细菌胞内遗传物质DNA作用

3.2结果

3.2.1抗菌活力与作用时间之间关系

3.2.2电镜观察细菌超微结构变化

3.2.3鲎素对细菌细胞膜通透性影响

3.2.4鲎素对细菌胞内遗传物质DNA结合作用

3.3讨论

3.3.1鲎素作用革兰氏阳性和阴性菌的区别

3.3.2鲎素抗菌肽多靶点作用机制

3.3.3鲎素抗菌肽对细菌超微结构的影响

3.4本章小结

第四章鲎素串联基因在枯草杆菌WB800中表达

4.1材料与方法

4.1.1主要仪器设备

4.1.2主要试剂和试剂盒

4.1.3菌株与质粒

4.1.4培养基

4.1.5主要试剂配制

4.1.6鲎素基因的获得

4.1.7大肠杆菌DH5a感受态细胞制备

4.1.8鲎素基因与载体pL3CM-T Vector的连接、转化

4.1.9阳性克隆的筛选

4.1.10转化子的菌落PCR鉴定

4.1.11重组质粒的核苷酸序列鉴定

4.1.12鲎素基因表达载体的构建

4.1.13重组表达载体转化枯草杆菌WB800

4.1.14重组转化子的筛选、鉴定

4.1.15鲎素在枯草杆菌WB800表达系统中的诱导表达

4.1.16重组鲎素的分离纯化

4.1.17鲎素串联表达产物2TAC的BrCN水解切割

4.1.18表达蛋白的抗菌活性检测

4.2实验结果

4.2.1鲎素串联基因的设计

4.2.2中国鲎血细胞总RNA提取电泳结果

4.2.3鲎素基因TAC的RT-PCR扩增及串联鲎素基因的电泳鉴定

4.2.4.pUCM-2TAC和pUCM-TAC基因的克隆和重组子鉴定

4.2.5重组质粒pUCM-2TAC和pUCM-TAC测序

4.2.6鲎素基因表达质粒的构建及重组表达载体的鉴定

4.2.7鲎素基因的重组转化菌的诱导表达及SDS-PAGE电泳鉴定

4.2.8表达蛋白2TAC和TAC的分离纯化

4.2.9表达蛋白的抗菌活性分析

4.3讨论

4.3.1鲎素抗菌肽基因的设计及基因表达问题

4.3.2鲎素抗菌肽基因在B.subtilis WB800中的高表达

4.3.3鲎素抗菌肽串联表达的优点

4.4本章小结

第五章 鲎素抗菌肽饲喂小鼠后对小鼠肠道微生物菌群的影响

5.1材料与方法

5.1.1主要仪器设备

5.1.2试验动物

5.1.3主要试剂

5.1.4主要试剂配置

5.1.5体外模拟鲎素在胃肠道内消化降解情况

5.1.6动物实验设计

5.1.7小鼠粪便样总细菌基因组DNA提取

5.1.8小鼠肠道微生物16S rDNA的PCR扩增

5.1.9 DGGE电泳与计算机相似性分析

5.1.10银染方法

5.1.11 DGGE特异条带的鉴定

5.2试验结果

5.2.1鲎素在体外模拟消化道环境中的降解情况

5.2.2小鼠粪便样细菌总DNA提取结果

5.2.3小鼠粪便样细菌16S rDNA的PCR扩增产物

5.2.4小鼠粪便样细菌群体的区系的DGGE电泳

5.2.5不同饲喂方式对小鼠肠道微生物相似性影响

5.2.6 DGGE特定条带的16S rDNA克隆识别

5.3讨论

5.3.1鲎素在体外模拟肠道消化环境中降解情况

5.3.2 PCR-DGGE技术分析小鼠肠道微生物区系变化

5.3.3 DGGE图谱中特异条带的分析

5.4本章小结

总结与展望

参考文献

附 录

攻读博士学位期间取得的研究成果

致 谢